張艷萍，周宗洲，黃婉鋒，張 敏，何作民，錢 鑫，關(guān)倩怡

(1.廣東省佛山市食品藥品檢驗檢測中心，廣東佛山 528051；2.廣東省佛山市疾病預(yù)防控制中心，廣東佛山 528051)

在人類生活的環(huán)境中，存在很多不同類型的真菌，一旦出現(xiàn)感染，對于身體的健康會產(chǎn)生消極的影響，真菌無孔不入，會威脅到人們的身體健康和生活工作，真菌感染容易引發(fā)腳氣，體癬，頭癬，甲癬、小兒鵝口瘡，以及女性真菌性陰道炎等各種疾病，對于這類疾病，一般通過涂擦抗真菌化學(xué)藥如酮康唑、制霉菌素就能達(dá)到治愈的目的，但隨著生活素質(zhì)的提高，大眾普遍認(rèn)為，抗真菌化學(xué)藥副作用大，純中藥成分制劑副作用相對較少，因而越來越受到大家的青睞，而這種心理會被某些不法生產(chǎn)廠家所利用，這些廠家通過突顯產(chǎn)品“綠色、健康、純天然”，以及迎合患者急于見效的心理，在生產(chǎn)的純中藥抗真菌外用制劑品種中非法添加含量未知的抗真菌類化學(xué)成分，從而達(dá)到增強(qiáng)療效的作用，雖然在治療疾病上一樣具有療效，但由于其添加的抗真菌類化學(xué)成分種類和含量未知，如果使用者在不知情下長期大量使用這類產(chǎn)品，會對人體的生理代謝產(chǎn)生毒副作用，同時易引起肝腎損傷，對人體造成損害。因此加強(qiáng)對外用制劑中非法添加抗真菌類化學(xué)成分類型及鑒別方法的分析研究，建立外用制劑中抗真菌類化學(xué)成分檢測方法極為重要，可以進(jìn)一步提高監(jiān)督管理部門對流通環(huán)節(jié)中假劣外用制劑的查處率，使制假違法行為得到有效遏制。

目前，關(guān)于抗真菌類化學(xué)成分檢測方法主要有高效液相色譜法[1-4]，液質(zhì)聯(lián)用法[5-8]，有報道的液質(zhì)聯(lián)用法同時測定抗真菌類化學(xué)成分最多為9種[9]，尚未有本實驗抗真菌化學(xué)成分舍他康唑和氟胞嘧啶的液質(zhì)聯(lián)用法報道，同時也尚未發(fā)現(xiàn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定本研究的13種抗真菌化學(xué)成分。《中國藥典》2015年版收載的抗真菌類藥物的檢測方法也是單一成分的檢測方法，將單一成分檢測方法應(yīng)用于監(jiān)管部門突發(fā)打假抽檢的藥品抗真菌類的檢測將耗費大量的檢測時間，并且無法達(dá)到監(jiān)管部門要求的快速出具檢驗報告的要求。

采用溶劑提取外用制劑中可能非法添加的咪康唑等13種抗真菌類化學(xué)成分，優(yōu)化色譜參數(shù)和質(zhì)譜參數(shù)，建立同時測定外用制劑中非法添加的咪康唑等13種抗真菌類藥物的UPLC-MS/MS 檢測方法。并將該方法應(yīng)用于抽檢的外用制劑檢驗，可快速為監(jiān)督監(jiān)管部門提供檢測數(shù)據(jù)，其檢驗報告可作為中藥制劑中非法添加咪康唑等抗真菌類藥物的有效判定依據(jù)。同時也將更好的應(yīng)對本地區(qū)藥品監(jiān)督非法添加應(yīng)急檢驗工作，為打擊售假、摻假提供科學(xué)技術(shù)依據(jù)，為藥品安全監(jiān)督檢驗工作提供技術(shù)保障和支持。

本文采用正離子檢測模式，多反應(yīng)檢測，建立同時測定咪康唑等13種抗真菌化學(xué)成分的UPLC-MS/MS檢測方法，進(jìn)行了方法學(xué)驗證，并應(yīng)用于外用制劑樣品檢測。該法簡便快速、方法靈敏度高，可用于外用制劑的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國Waters xevo TQ三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，瑞士梅特勒-托利多XPR10電子分析天平，美國賽多利斯BS 224S電子天平，對照品氟胞嘧啶(批號 100315-201502，含量100%)、氟康唑(批號 100314-201204，含量99.8%)、醋酸氯己定(批號100183-201003，含量96.9%)、酮康唑(批號 100294-200602，含量99.9%)、鹽酸萘替芬(批號100823-200501，含量100%)、克霉唑(批號100037-200306，含量100%)、伏立康唑(批號100862-201402，含量99.2%)、鹽酸特比萘芬(批號100563-201402，含量99.9%)、伊曲康唑(批號100631-201402，含量99.2%)、硝酸益康唑(批號100214-201204，含量99.6%)、灰黃霉素(批號130426-9101，含量99.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院，咪康唑(批號2-AGE-8-1，含量98%)、購自TRC硝酸舍他康唑(批號S0460000，含量100%)、購自EP。甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為色譜純，水為超純水。供試品為監(jiān)管部門提供的監(jiān)督抽檢樣品和自行購買的網(wǎng)絡(luò)熱銷樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

2.1.1對照品儲備液

精密稱取各對照品約4mg于20ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為200μg·mL-1的對照儲備液。

2.1.2混合對照品中間液

分別精密吸取氟胞嘧啶、醋酸氯己定、酮康唑各2.00ml；氟康唑、伊曲康唑、灰黃霉素各0.50ml；伏立康唑0.125ml；萘替芬、克霉唑、特比奈酚、咪康唑、舍他康唑0.05ml；益康唑0.025ml至同一20ml容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成氟胞嘧啶、醋酸氯己定、酮康唑質(zhì)量濃度為20μg·mL-1；氟康唑、伊曲康唑、灰黃霉素質(zhì)量濃度為5μg·mL-1；伏立康唑質(zhì)量濃度為1.25μg·mL-1；萘替芬、克霉唑、特比奈酚、咪康唑、舍他康唑質(zhì)量濃度為0.5μg·mL-1；益康唑質(zhì)量濃度為0.25μg·mL-1的混合對照品中間液。

2.1.3混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制

準(zhǔn)確移取混合對照品中間液適量，配制氟胞嘧啶、醋酸氯己定、酮康唑貝濃度范圍約為0.08～2.0μg·mL-1，氟康唑、伊曲康唑、灰黃霉素濃度范圍約為0.02μg·mL-1～0.50μg·mL-1，伏立康唑濃度范圍為0.05μg·mL-1～0.125μg·mL-1，萘替芬、克霉唑、、特比奈酚、咪康唑、舍他康唑濃度范圍約為0.002μg·mL-1～0.05μg·mL-1，益康唑濃度范圍約為0.001μg·mL-1～0.025μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取固體樣品0.2g或精密量取溶液2.0ml于20mL容量瓶中，加入50%乙腈溶液，漩渦振蕩器振蕩1min,再超聲提取20min,靜置，用50%乙腈溶液定容至刻度，混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，10000r.min-1離心10min，取上清液過0.22μm濾膜，作為供試品溶液，如果供試品溶液的濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，可用10%乙腈溶液適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，再進(jìn)行分析。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1色譜條件

色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×100mm，1.7μm)流動相為含0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫：0.0～1.0min，90%A；1.0～2.3min，90%A～70%A；2.3～6.0min，70%A～60%A；6.0～7.0min，60%A～50%A；7.0～8.5min，50%A～30%A；8.5～9.5min，30%A～20%A；9.5～9.6min，20%A～90%A；9.6～11.0min，90%A；柱溫：30℃,流速：0.30mL/min,進(jìn)樣量：1μL。

2.3.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測，離子源溫度:150℃，毛細(xì)管電壓：3.5KV，脫溶劑溫度：550℃，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，其各組分質(zhì)譜參數(shù)見表1，標(biāo)準(zhǔn)TIC圖譜見圖1。

表1 13種化學(xué)成分質(zhì)譜參數(shù)

2.4 線性關(guān)系考察

取混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液各1uL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果見表2，表明質(zhì)量濃度在規(guī)定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99。同時將適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液加入不含上述13種抗真菌成分的樣品中，按“2.2”進(jìn)行樣品處理，以信噪比為3∶1時計算檢測下限(LOD)，以信噪比為1∶1時計算定量下限(LOD)結(jié)果見表2。

表2 13種化學(xué)成分的線性范圍及相關(guān)系數(shù)等

2.5 精密度試驗

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中一濃度1μl,連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰峰面積，計算13種抗真菌類藥物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果分別為4.2%、3.6%、3.4%、2.9%、3.0%、2.5%、2.6%、1.5%、2.2%、3.5%、1.2%、2.3%、1.8%；試驗結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.6 回收率實驗

精密稱取6份不含上述13種抗真菌化學(xué)成分的樣品0.20g，添加低、中、高3種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，按“2.2”進(jìn)行樣品處理，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀測定，計算回收率。結(jié)果表明：13種抗真菌化學(xué)成分加標(biāo)回收率為87.4%～113.5%，RSD為1.1%～6.9%，均能滿足方法學(xué)要求。結(jié)果見表3。

表3 13種抗真菌化學(xué)成分回收率及精密度試驗結(jié)果(n=6)

2.7 方法應(yīng)用

按照上述建立液質(zhì)方法，對10批抽樣樣品和網(wǎng)購熱銷樣品進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有6批樣品檢出抗真菌類化學(xué)成分，抽檢樣品3批，網(wǎng)購樣品3批，其樣品代表圖譜見圖2，樣品具體檢測結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果(mg·g-1)

3 討論

3.1 提取方法優(yōu)化

抗真菌化學(xué)成分一般均能溶于乙腈、甲醇[10-11]，但由于樣品劑型多樣，基質(zhì)成分復(fù)雜，試驗發(fā)現(xiàn)，部分樣品，特別是膏劑，在純甲醇或純乙腈溶劑未能均勻分撒，可能會造成非法添加的抗真菌化學(xué)成分無法完全提取。而用甲醇水溶液或乙腈水溶液則可以避免樣品上述情況，同時也可以避免液質(zhì)聯(lián)用溶劑效應(yīng)的影響，本文分別考察了不同體積比的甲醇水溶液和乙腈水溶液，發(fā)現(xiàn)采用50%乙腈溶液進(jìn)行提取，基質(zhì)干擾較小，方便快捷。同時也考察了不同的提取時間(超聲10min、20min、30min)對提取效率的影響及整體考慮有些組分的穩(wěn)定性，最終樣品超聲時間選擇20min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本實驗嘗試了不能比例的甲酸水-甲醇系統(tǒng)、甲酸水-乙腈系統(tǒng)、甲酸胺-甲醇系統(tǒng)、乙酸銨-乙腈系統(tǒng)溶液等流動性組合進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液分離度最佳，各化學(xué)成分峰型較好。本實驗分析了UPLC BEH C18、C8兩款色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)C18柱無論從分離度，峰形等方面都優(yōu)于C8柱，最終選擇C18色譜柱，同時分析比較了在同一梯度條件下不同柱長UPLC BEH C18柱的分離效果，雖然短柱分析速度快，但組分咪康唑舍和他康唑完全重合，未能達(dá)到分離要求，因此選擇柱長為100mm的C18色譜柱。

3.3 樣品檢測結(jié)果分析

應(yīng)用本方法對10批外用制劑進(jìn)行了分析測定，1批次檢出酮康唑和咪康唑，含量分別為0.2mg·g-1、11.3mg·g-1，1批次檢出咪康唑和特比萘芬含量分別為10.9mg·g-1、2.0mg·g-1,4批次檢出咪康唑，含量分別為26.7mg·g-1、32.3mg·g-1、6.4mg·g-1、18.1mg·g-1。從結(jié)果可知，在外用制劑中抗真菌類成分檢出率非常高，特別是咪康唑，10批樣品中有6批樣品中檢出，咪康唑是高效、安全、屬于咪唑類廣譜抗真菌藥，對致病性真菌幾乎都有作用，廣泛用于如頭癬、手癬、腳癬、但其具有較強(qiáng)的毒副作用和耐藥性，盲目使用對患者身心健康有較大影響。從檢測結(jié)果可知，外用制劑膏劑中添加抗真菌類化學(xué)成分非常嚴(yán)重，部分膏劑屬于消字號外用制劑，其本應(yīng)只具有皮膚清潔，衛(wèi)生和消毒作用，并不具有藥物的治療功效，而且沒有經(jīng)過嚴(yán)格的藥品試驗論證，其不良反應(yīng)并不明確，這類產(chǎn)品被不良生產(chǎn)廠家宣傳為“純中藥配方”，卻暗地里大量添加化學(xué)成分，消費者長期使用后很可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果，希望能引起有關(guān)監(jiān)管部門的重視，保障市民用藥科學(xué)、安全有效。

本研究所建立的方法可同時用于外用制劑中可能非法添加的13種抗真菌類化學(xué)成分的定性篩查和定量分析，在10min中內(nèi)完成了對所有化合物的分析測定，在保證分離的情況下，實現(xiàn)了快速有效的高通量分析，檢測的化合物較為全面，可為監(jiān)測外用制劑中非法添加抗真菌藥物提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。本分析方法靈敏，精密度高，回收率好，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、多反應(yīng)監(jiān)測方法能很好的排除復(fù)雜制劑中背景干擾，結(jié)果準(zhǔn)確、真實，可作為分析添加違禁藥物的有效手段，為打擊外用制劑的制假行為，提供了有利的技術(shù)保障。