馮智翱，薄彧坤，楊 丹，安 明*

(1.包頭醫(yī)學院藥學院2019級研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

嘎日迪-15丸是由草烏(制)、麝香、訶子、木香、石菖蒲、梔子、川楝子、決明子、茼麻子、楓香脂、五靈脂、文冠木、瞿麥、黑云香、沉香共15味藥組成。具有燥“協(xié)日烏素”、消“黏”、治療游痛癥，瘡瘍、消腫作用的功效，尤其對風濕、骨關(guān)節(jié)疾病有突出的療效[1]。訶子為嘎日迪-15丸中的主藥具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、保肝等功效，沒食子酸為其主要活性物質(zhì)。本實驗參考訶子相關(guān)含量測定文獻以及2015年版《中國藥典》中沒食子酸的含量測定方法。建立了測定沒食子酸的高效液相色譜法。該方法操作簡單，專屬性強。目前嘎日迪-15質(zhì)量控制方面無含量測定項。本實驗將采用HPLC法對其中的沒食子酸含量進行測定。為該藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器UItimate

3000系列高效液相色譜儀、SartoriusBSA224S-CW電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 試劑

甲醇色譜純，磷酸分析純，實驗用水為超純水。

1.3 試藥

沒食子酸(110931-201705)，訶子對照藥材(122015-201705)均由中國食品藥品檢定研究院提供；嘎日迪-15(807311、901111、807312由包頭市蒙中醫(yī)院制劑室提供)；模擬樣(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

SHIMADZU-C18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；流動相為甲醇-0.05%磷酸水溶液(10∶90)；柱溫：30℃；檢測波長：272nm[2]；流速：1.0ml·min-1；進樣量：10μl。理論板數(shù)4000以上。

2.2 對照品溶液的制備

準確稱取沒食子酸對照品10.21mg，置100ml容量瓶中加50%甲醇溶解(用于加樣回收率實驗)。取1ml于10ml容量瓶中加50%甲醇溶解至刻度，制成濃度為10.21μg/ml的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品精密稱定約0.2g，置具塞錐形瓶中。精密加入50%的甲醇50ml稱重。超聲處理40min、冷卻、50%的甲醇補重。過濾取續(xù)濾液，用0.22um微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性溶液的制備

按照處方比例取嘎日迪-15丸中除訶子以外的其他藥材，準確稱定，研細，照“2.3”項下方法制成陰性溶液。

2.5 訶子藥材溶液的制備

稱取訶子藥材約0.014g，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50ml稱重。超聲處理40min、冷卻，50%的甲醇補重，過濾取續(xù)濾液,經(jīng)0.22um微孔濾膜濾過，即得。

2.6 模擬樣溶液的配制

按照處方比例稱取嘎日迪-15所需藥材，混合，研細。準確稱定約0.2g,置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50ml稱定重量，超聲處理40min放冷，再次稱重并用50%的甲醇補重，在5000r/min的離心機中離心10min，取續(xù)濾液,經(jīng)0.22um微孔濾膜濾過，即得[3]。

2.7 專屬性試驗

對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下的色譜條件測定。結(jié)果證明，供試品溶液中沒食子酸的分離度良好。對照品溶液和供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，陰性對照溶液無干擾。由此證明此方法專屬性良好[4]。結(jié)果見附錄，圖1～圖3。

2.8 提取效率試驗

2.8.1超聲時間的選擇

提取溶劑為50%甲醇50ml.分別超聲提取30min，40min，50min?？疾觳煌曁崛r間對提取效率的影響，結(jié)果見表1[5]。

表1 超聲時間的選擇試驗

表1表明，提取時間為40min沒食子酸的含量最高，故選擇超聲時間為40min。

2.8.2提取溶劑的選擇

以25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇50ml作為提取溶劑，超聲提取40min。試驗中考察了溶劑甲醇與水的比例不同對提取效率的影響，結(jié)果見表2。

表2 提取溶劑的選擇試驗

表2表明，甲醇水比例為50%時提取效率最高，故選擇50%的甲醇水作為溶劑進行提取試驗。

2.8.3提取溶劑量加入量的考察

以50%甲醇25ml、50ml、100ml作為提取溶劑，超聲提取40min，考察溶劑的量不同對提取效率的影響，結(jié)果見表3。

表3 提取完全試驗考察

表3表明，50%甲醇50ml,超聲提取40min時的提取效率最高，故選擇50%甲醇50ml超聲提取40min來進行溶液的配制。

2.9 線性關(guān)系考察

取10mg(實際取了0.01021g)沒食子酸對照品入20ml容量瓶加50%甲醇至刻度線搖勻。后取1ml入25ml容量瓶加溶劑至刻度線，制成20.42μg/ml的對照品溶液。分別用移液管精密吸取2ml、4ml、6ml、8ml入10ml容量瓶，分別稀釋成4.08μg/ml、8.17μg/ml、12.25μg/ml、16.34μg/ml、20.42μg/ml的對照品溶液。各吸取10ul注入高效液相色譜儀中。以峰面積對濃度進行回歸分析，結(jié)果顯示沒食子酸4.08μg/ml～20.42μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.522679x+0.0249(r=0.9999，n=5)。結(jié)果見表4。

表4 沒食子酸的標準曲線

結(jié)果顯示：沒食子酸在4.08μg/ml～20.42μg/ml的濃度范圍內(nèi)同相應峰面積呈良好的線性關(guān)系。標準曲線見附錄，圖4。

2.10 精密度試驗

取2.2項下的沒食子酸對照品溶液,按照2.1項下的色譜條件連續(xù)進樣5針，進樣量10μl，其峰面積的平均值為5.4878，RSD為0.13%。說明儀器精密度良好。

2.11 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，在0h,2h,4h,8h,12h,24h的時間點按照2.1項下條件進行測定，結(jié)果見表5。沒食子酸的峰面積積分值的RSD值為0.71%，表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

表5 不同時間測定樣品中沒食子酸的峰面積積分值

2.12 重復性試驗

取同一批號樣品(批號807311)6份，每份各取約0.2g，按照“2.3”項下的方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行含量測定，沒食子酸含量的RSD值為0.89%結(jié)果見表6。色譜圖見附錄，圖5。

表6 重復性試驗含量測定結(jié)果

由表中數(shù)據(jù)可知，嘎日迪-15的重復性良好。

2.13 加樣回收率試驗

精密稱定供試品(批號807311)9份，每份約0.1g，分別置于9個具塞錐形瓶中并分成三組。每組分別用移液管加入沒食子酸對照品溶液(102.1μg/ml)1ml，2ml,3ml。(約相當于供試品含量的50%，100%，150%)，再加入50%甲醇49ml，48ml，47ml，照2.3項下的方法處理后各10μl注入高效液相色譜儀中。得沒食子酸的平均回收率為100.65%，RSD值1.12%結(jié)果見表7。

表7 加樣回收率測定結(jié)果

結(jié)果表明：本方法具有較好的回收率。

3 樣品含量測定

取樣品三批(批號為：807311、901111、807312)每批兩份，模擬樣品兩批每批兩份，按2.3項下的方法處理并測定，測定結(jié)果見表8。

表8 樣品測定結(jié)果

用相同方法對模擬樣品中的訶子藥材進行測定，測的結(jié)果見表9。

表9 訶子藥材中沒食子酸的含量測定

按理論值折算，模擬樣品應含沒食子酸 1.92mg/g,沒食子酸轉(zhuǎn)移率=1.92/1.925×100%=100.1%。由于2015版《中國藥典》一部中沒有訶子的含量指標，在確定本品含量時，測定了2批訶子藥材，平均含沒食子酸為24.50mg/g。本品含量限度為=14.2/199.51×24.503×100.16%=1.745mg/g?？紤]到藥材質(zhì)量差異，下浮10%，故暫定本品每1.0g含訶子以沒食子酸(C5H6O5)計不得少于1.57mg。

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

參考《中國藥典》中沒食子酸的檢測波長為271nm。取2.2項下溶液，自200nm-600nm通過二極管陣列檢測器做光譜掃描。沒食子酸在波長272nm與216nm處有最大吸收且分離度良好，所以選用272nm做為檢測波長[6]。

4.2 流動相的選擇

參照《中國藥典》2015年版四部“沒食子酸”項下的流動相條件0.05%磷酸溶液-甲醇(93∶7)進行摸索。此條件下沒食子酸峰形良好且無干擾，但保留時間較晚。因此，流動相確定為0.05%磷酸溶液-甲醇(90∶10)[7]。

4.3 提取溶劑的選擇

參照內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范,“蘇日也”丸項下沒食子酸的含量測定方法，選用甲醇作為提取溶劑。根據(jù)2.8項下的試驗得出，以50%甲醇50ml為溶劑超聲40min的提取效率最佳。

5 結(jié)論

采用高效液相色譜法測定嘎日迪-15中沒食子酸的含量，結(jié)果分離度良好。本含量測定方法簡便快捷，專屬性強，重現(xiàn)性好?？勺鳛楦氯盏?15的質(zhì)量控制的標準。