王建國，康 蕊，呼格吉勒?qǐng)D，梁紅玉，紅 麗，閆 麗，張 煥，周旋澤，梁國棟*

(1.內(nèi)蒙古鴻茅藥業(yè)有限責(zé)任公司 013750；2.內(nèi)蒙古盛唐國際蒙醫(yī)藥研究院有限公司 010010)

鴻茅藥酒由紅曲、小茴香、肉桂、高良姜、蓽茇等六十七味藥材組成的復(fù)方制劑，標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十四冊(cè)(標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3-B-2792-97)，目前標(biāo)準(zhǔn)中沒有含量測(cè)定項(xiàng)。鴻茅藥酒處方中紅曲藥材占比最高，紅曲中富含他汀類物質(zhì)，主要成分是洛伐他汀。為保證紅曲產(chǎn)品的功效，生產(chǎn)上常要求其中洛伐他汀的含量達(dá)到一定水平。本文根據(jù)紅曲在鴻茅藥酒處方中占有較多(4.8mg/ml)的特點(diǎn)，以紅曲中洛伐他汀為指標(biāo)成分，進(jìn)行HPLC含量測(cè)定方法的驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津LC-20AT)和(美國Waters H class型)；百萬分之一電子天平(Mettler-T0ledo MS105DU型)；萬分之一電子天平(SHIMADZU AUY220型)。

1.2 試劑與試藥

鴻茅藥酒各批號(hào)供試品由內(nèi)蒙古鴻茅國藥股份有限公司提供；洛伐他汀對(duì)照品(批號(hào)100600-201805,99.7%)，由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純,水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法學(xué)考察

2.1色譜條件：采用Shim-pack GIST C18,250mm×4.6mm I.D，5μm色譜柱和Bonshell C18Plus 4.6mm×50mm，2.7μm色譜柱；以甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相，洛伐他汀的分離度大于1.5；30℃柱溫；檢測(cè)波長237nm；理論板數(shù)以洛伐他汀峰計(jì)4000以上。

2.2實(shí)驗(yàn)用溶液的制備：取鴻茅藥酒250ml，精密量取，置坩堝中，水浴濃縮至約50ml，緩緩加入無水乙醇100ml，攪拌，轉(zhuǎn)入三角瓶中，超聲溶解30分鐘，置冷藏箱(2-6℃)中放置2小時(shí)，使糖分充分沉淀。取上清液，濾過，濾液置250ml坩堝中，沉淀和燒瓶用無水乙醇20ml分次洗滌，濾過，合并濾液，濃縮至近干，加20ml、20ml、10ml甲醇分次溶解，轉(zhuǎn)移到50ml量瓶中，并稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。另外，取洛伐他汀對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含 40μg的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再取按處方比例并以相同工藝制備的缺紅曲的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備法制得陰性對(duì)照溶液。

2.3專屬性考察：在上述色譜條件下,分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液、供試品溶液各10μl，分別注入液相色譜儀。

測(cè)得結(jié)果為：陰性對(duì)照色譜圖中在與洛伐他汀對(duì)照品以及供試品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，表明其他組分對(duì)洛伐他汀的測(cè)定干擾。見供試品圖譜、洛伐他汀對(duì)照品圖譜、陰性對(duì)照?qǐng)D譜。

2.4線性關(guān)系：取洛伐他汀對(duì)照品約4.0mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(對(duì)照品溶液實(shí)際濃度為40.1μg/ml)；分別吸取對(duì)照品溶液6.0μl、8.0μl、10.0μl、12.0μl、14.0μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。洛伐他汀在0.2406μg-0.5614μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=2.65×106x-207.11，r=0.9999。標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值見表1。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖2。

表1 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值表

2.5取同一份供試品(批號(hào)：20191101)，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定。5針精密度RSD(%)=0.42；15h穩(wěn)定性RSD(%)=0.35；5份供試品重復(fù)性RSD(%)=0.38。

2.6加樣回收試驗(yàn)：精密量取含有洛伐他汀為9.86μg/ml的鴻茅藥酒6份，各125ml，加入1.53mg/ml洛伐他汀對(duì)照品溶液5ml，按供試品制備方法制備并測(cè)定。加樣回收率結(jié)果見表2。

表2 洛伐他汀加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果：本方法的平均回收率為102.4%，符合《中國藥典》2015年版四部9101“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”中“表2樣品中待測(cè)定成分含量和回收率限度”的要求。

3 樣品含量測(cè)定

取樣品約250ml，各兩份，精密量取，制備并測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 樣品中洛伐他汀的含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 提取方法的選擇

由于鴻茅藥酒是由67味藥材和糖、白酒構(gòu)成，藥材種類多，平均每味藥材的量較少，再加上糖的干擾，供試品前處理比較難。經(jīng)過對(duì)前處理方法比較，大孔樹脂柱吸附法、氧化鋁柱分離法、萃取法等處理樣品方法，操作過程繁瑣、時(shí)間較長，回收率僅能達(dá)到60%，測(cè)定結(jié)果平行性差，因此，以上處理方法作為含量測(cè)定均無法采用。

本文采用直接濃縮、乙醇溶解被測(cè)組分的方法，可以排除大量糖的干擾，再將乙醇回收、殘?jiān)状既芙庾鳛楣┰嚻啡芤旱闹苽浞椒?。該方法的?yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，能夠排除糖的影響；對(duì)待測(cè)組分有富集作用，回收率較高；制備的供試品溶液黏度很小，沒有造成對(duì)色譜柱的堵塞等現(xiàn)象。故，前處理樣品采用此制備方法。

4.2 柱溫的選擇

采用30℃柱溫可以保證柱壓較低，消除殘留在樣品溶液的糖分影響，分離效果穩(wěn)定，保留時(shí)間變化小。溫度的變化，對(duì)洛伐他汀出峰時(shí)間有影響，但對(duì)峰面積的影響較小。

5 結(jié)果

HPLC對(duì)鴻茅藥酒中紅曲藥材的指標(biāo)性成分測(cè)定，經(jīng)分析方法驗(yàn)證，表明該方法重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，方中其它組分對(duì)洛伐他汀的測(cè)定無干擾，為修訂鴻茅藥酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。