歐陽冰，王顯鳳，宋宏宇，龍世林，王林麗

（中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院藥劑科，重慶 400042）

香芍散結(jié)口服液是中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院藥劑科王林麗主任中藥師根據(jù)中醫(yī)理論，經(jīng)多年基礎(chǔ)科研和臨床實踐研制而成的中藥制劑，為我院非標準中藥制劑［1］，由香附、當(dāng)歸、丹參、白芍等中藥組方，具有疏肝解郁、養(yǎng)血柔肝、活血化瘀、理氣止痛、清熱散結(jié)等功效，對乳腺增生癥、男性乳腺發(fā)育癥有明顯療效。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對方中白芍、當(dāng)歸、丹參、香附進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定方中白芍主要活性成分芍藥苷的含量，以控制該制劑的質(zhì)量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Sartorius BT25S型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為十萬分之一）；KQ-50B型超聲波清洗儀（昆明市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；雙槽層析缸；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，規(guī)格為100 mm×200 mm）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號為110736-201438，含量為96.4% ），阿魏酸對照品（批號為 110773-201313），當(dāng)歸對照藥材（批號為120927-201014），原兒茶醛（批號為 110810-201007），α-香附酮（批號為 110748-201513），均購自中國食品藥品檢定研究院；香芍散結(jié)口服液（醫(yī)院制劑，批號分別為 170104，170224，170324）；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

白芍：取樣品20 mL，分別用20 mL水飽和正丁醇提取3次，合并提取液，水浴蒸干，殘渣加2 mL乙醇溶解，作為供試品溶液。再取缺白芍的樣品藥材，同法制備陰性對照品溶液。另取芍藥苷對照品，精密稱定，用甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水（40∶5∶10∶0.2，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖

丹參：取樣品30 mL，分別用25 mL乙醚萃取2次，合并提取液，水浴蒸干，用無水乙醇1 mL溶解殘渣，作為供試品溶液。再取缺丹參的樣品藥材，同法制備陰性對照品溶液。另取原兒茶醛對照品，精密稱定，加乙醇制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一羧甲基纖維素鈉硅膠G薄層板上，以二氯甲烷 -甲醇 -無水甲酸（10∶0.8∶0.2，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2% 間苯三酚無水乙醇硫酸（1∶1）混合溶液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

當(dāng)歸：取樣品10 mL，加20 mL水飽和乙酸乙酯處理，提取液水浴蒸干，殘渣用無水乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。再取缺當(dāng)歸的樣品藥材，同法制備陰性對照品溶液。另取阿魏酸對照品，精密稱定，加乙醇制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷 -乙酸乙酯 -甲酸（2∶1∶0.5，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

香附：取樣品20 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超聲30 min，濾過，水浴蒸干，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。再取缺香附的樣品藥材，同法制備陰性對照品溶液。另取α-香附酮對照品，精密稱定，用乙酸乙酯制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶2∶2∶0.1，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的黃色斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.1%磷酸溶液（15 ∶85，V／V）；柱溫：室溫；流速：1 mL ／min；進樣量：10 mL；檢測波長：230 nm。

2.2.2 溶液制備

取干燥至恒重的芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，定容至50mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為50μg／mL的對照品溶液。精密吸取5 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇30 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為50 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按處方組成精密量取缺白芍藥材的香芍散結(jié)口服液陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

空白干擾試驗：取2.2.2項下3種溶液，按擬訂色譜條件進樣檢測，對照品芍藥苷溶液色譜的保留時間約5 min，供試品溶液色譜中的芍藥苷與其他成分達基線分離，分離較好，陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

線性關(guān)系考察：取芍藥苷對照品24.94 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，即得質(zhì)量濃度為0.249 4 mg／mL的芍藥苷貯備溶液，精密吸取上述貯備溶液適量，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成7個不同質(zhì)量濃度的梯度對照品溶液（0.007482，0.024 94，0.049 98，0.074 82，0.099 76，0.149 64，0.249 40 mg／mL），依次測定。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝40 485X＋80.775，R2＝0.998 3（n＝7）。結(jié)果表明，芍藥苷質(zhì)量濃度在 0.007 482～0.249 4 mg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密量取對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件重復(fù)進樣6次。結(jié)果峰面積的RSD為0.72%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液（批號為170104），分別于 0，1，2，4，8，12 h 時按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果峰面積的RSD為0.49%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為170104）5份，依法平行制備供試品溶液，并按擬訂色譜條件進樣測定樣品中芍藥苷的平均含量。結(jié)果平均含量為0.62 mg／mL，峰面積的RSD為1.17%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為170104）2.5 mL，置 50 mL 容量瓶中，按低、中、高濃度分別精密加入芍藥苷對照品溶液（0.249 4 mg ／mL）5.6，9.3，13.0 mL，依法平行制備 3份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 芍藥苷加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

定量限測定：取芍藥苷對照品溶液（0.007482 mg／mL）適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制備成不同質(zhì)量濃度的梯度對照品溶液，依法進樣測定，取芍藥苷信噪比（S／N）為10∶1時的質(zhì)量濃度作為定量限，結(jié)果為 0.194 1 μg ／mL。

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，每批3份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算香芍散結(jié)口服液中芍藥苷的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

香芍散結(jié)口服液是臨床驗方，療效確切，但缺乏內(nèi)在質(zhì)量控制方法，制劑質(zhì)量穩(wěn)定性難以保障，可能會影響其臨床療效的穩(wěn)定。該制劑含14味中藥，成分復(fù)雜，干擾多，給質(zhì)量控制方法的建立帶來一定困難。選取方中的主藥香附、當(dāng)歸、丹參、白芍進行TLC鑒別，通過系統(tǒng)的樣品預(yù)處理，展開劑優(yōu)化，并均做陰性對照試驗。結(jié)果表明，各藥材的主要薄層斑點均不受其他藥材干擾，經(jīng)方法學(xué)考察驗證，表明該方法專屬性強，重復(fù)性好，可用于方中主要藥材香附、當(dāng)歸、丹參、白芍的定性鑒別。

表2 3批樣品中芍藥苷含量測定結(jié)果（n＝3）

白芍是香芍散結(jié)口服液中的主藥，而芍藥苷是白芍主要活性成分，藥理作用多樣，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗癌、抗抑郁和抗肝纖維化等功效，對自身免疫性疾病、心腦血管疾病和神經(jīng)退行性疾病也能起到改善和治療作用［2-5］，是香芍散結(jié)口服液發(fā)揮疏肝解郁、理氣止痛等功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，故選擇芍藥苷作為香芍散結(jié)口服液質(zhì)量控制定量指標成分。通過樣品預(yù)處理、色譜柱選擇和流動相優(yōu)化等建立了該制劑中芍藥苷的定量分析方法。查閱文獻［6-15］，本研究中建立的方法在柱效和分離度方面均得到了優(yōu)化，簡便快捷，準確度較高，可為香芍散結(jié)口服液質(zhì)量標準的提升奠定基礎(chǔ)。