■張 宇 高佳朋 韓和平 夏 輝 李雪鶴 荊冰妍 吳 彥 郭 冉*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學海洋學院，河北秦皇島066003；2.河北省秦皇島廣播電視大學，河北秦皇島066000；3.河北省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，河北秦皇島066003）

大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）自1992年引入我國后，養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，近十年年平均產(chǎn)量可達5.7萬噸，是我國北方主要的海水養(yǎng)殖魚類之一[1]。大菱鲆是肉食性魚類，以工廠化養(yǎng)殖模式為主，對配合飼料的蛋白質(zhì)要求較高[2-3]，主要以魚粉作為蛋白源[4]。我國面對飼料行業(yè)對于魚粉需求的緊迫壓力，尋找新的蛋白源替代魚粉是養(yǎng)殖業(yè)和飼料企業(yè)的重大需求[5]。

羽毛粉水解肽一直存在著氨基酸不平衡，角蛋白和硬質(zhì)蛋白不易吸收的問題，本試驗所用酶解肽為利用生物酶技術(shù)將羽毛粉和血粉混合酶解后的功能性混合肽，具有氨基酸較平衡，吸收率高等優(yōu)點。小肽作為蛋白質(zhì)降解過程中的中間產(chǎn)物，具有吸收速度快，耗能低和其他營養(yǎng)物質(zhì)吸收過程無競爭等優(yōu)點，而且生產(chǎn)成本較低，蛋白質(zhì)含量較高，可以作為魚粉替代中的一種蛋白源[6]。姚清華等[7]研究表明羽毛粉類小肽產(chǎn)品較為適合作為大黃魚飼料蛋白源，其次依次為日本鰻鱺、凡納濱對蝦、雜色鮑的飼料蛋白源。施用暉等[8]研究表明，在產(chǎn)蛋雞日糧中添加小肽制品后，其產(chǎn)蛋率和飼料轉(zhuǎn)化率有明顯的提高，雞蛋殼的硬度也有提高的趨勢。目前發(fā)現(xiàn)小肽制品只能低比例替代魚粉，如何提高小肽制品在作為新型蛋白源替代水產(chǎn)動物配合飼料中魚粉是值得思考的問題，我們前期研究表明酶解肽制品替代大菱鲆配合飼料中魚粉比例超過8%時，會降低其生長性能，超過16%時會嚴重影響大菱鲆的脂肪吸收代謝機能[9]，因此我們推測高比例替代魚粉組大菱鲆體內(nèi)的膽汁酸合成代謝可能受到影響。

膽汁酸是一種在肝臟中由膽固醇合成的兩性甾醇類化合物[10-11]，是膽汁中的重要成分。膽汁酸能夠促進脂質(zhì)的消化代謝，在調(diào)節(jié)機體脂肪的消化代謝過程中起著不可或缺的作用[12]。因此，本試驗以大菱鲆為研究對象，在不同比例酶解肽替代魚粉條件下補充膽汁酸，研究其對大菱鲆生長性能、消化代謝和脂肪累積的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與試驗配方

酶解肽來自秦皇島益爾生物科技有限公司，主要營養(yǎng)成分見表1，膽汁酸（分析純）購買自麥克林試劑有限公司。飼料所有原料經(jīng)粉碎后過60 目篩并按照配方中比例逐級混勻再加入大約20%純水攪拌均勻，用膨化飼料機（江門市江晟電機廠有限公司Y80MT-2）制成直徑大約1.5 mm 的顆粒狀飼料，自然晾干12 h 后（飼料水分2%），將其放于-20 ℃冰箱中備用。試驗配方和主要營養(yǎng)水平見表2。

表1 酶解肽主要營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

表2 試驗飼料組成和營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

全魚粉組作為基礎(chǔ)飼料D0，其他四組分別為等比例替代魚粉7% D1、14% D2、7%加膽汁酸組D3、14%加膽汁酸組D4。膽汁酸添加量為0.05%，以三氧化二釔作為指標物。試驗用大菱鲆魚來自營口文慧生物飼料有限公司，養(yǎng)殖試驗在河北農(nóng)業(yè)大學海洋學院水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖重點實驗室進行。養(yǎng)殖用水族箱（40 cm×50 cm×60 cm）為室內(nèi)水族箱，先將大菱鲆魚在水族箱內(nèi)暫養(yǎng)兩周，投喂商業(yè)飼料（蛋白≥50%，脂肪≥10%）。然后隨機挑選大小均勻，體質(zhì)健壯初始體質(zhì)量為(12.15±0.03) g的大菱鲆魚450條，每組三個重復(fù)，每個重復(fù)為一個水族箱放30 尾魚。養(yǎng)殖用水為自然海水，鹽度為(30±1)‰，經(jīng)過紫外消毒、沉淀、砂濾的過程進入養(yǎng)殖系統(tǒng)，養(yǎng)殖系統(tǒng)為室內(nèi)流水系統(tǒng)，整個養(yǎng)殖期間24 h供氧，每天12 h日光燈照射，每天早8:00 和晚8:00 飽食投喂兩次，每天喂食1 h 后吸出剩余殘餌和糞便，用于計算飼料系數(shù)。每天換水量為整個系統(tǒng)的1/3～1/2。試驗過程中每天測定水溫，記錄天氣及進食情況，每兩周進行一次溶氧、pH值、氨氮、亞硝酸鹽的檢測。試驗周期為8 周。養(yǎng)殖全程水溫（17±1）℃，溶氧含量（8±0.3）mg/l，pH值在8.0～8.6，氨氮（0.49±0.12）mg/l。

1.3 樣品采集

試驗開始4 周后開始收集糞便，每次投喂飼料1 h后先排出殘餌然后再用吸管吸出新鮮、飽滿、成型的糞便，放入-80 ℃冰箱中用于消化率的檢測。試驗結(jié)束后，將大菱鲆空腹24 h，拭干大菱鲆體表水分后稱量每個水族箱中大菱鲆總重、并計數(shù)，用于計算大菱鲆生長指標中的存活率、增重率和特定生長率。每個水族箱隨機選出3 條魚用MS222 麻醉后用于體成分分析。另取5 尾魚麻醉后量其體長、體重，用于計算肥滿度等指標，然后用1 ml 一次性注射器（肝素鈉潤洗）從尾靜脈抽血，放置4 ℃冰箱冷藏室過夜后在4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，取上清液用于血漿生化指標（葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、總膽汁酸）和理化指標的檢測。摘取肝臟用生理鹽水漂洗后用濾紙拭干水分后稱重，經(jīng)研磨后4 ℃、2 500 r/min 離心10 min取上清液用于消化代謝指標的檢測。最后刮取大菱鲆背部肌肉用于背肌蛋白、脂肪和灰分的檢測。

1.4 指標測定方法

1.4.1 生長和體成分指標

魚體和飼料常規(guī)成分分析參照AOAC 法[13]。飼料及糞便中三氧化二釔的含量通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國thermo公司iCAPQ）檢出。

1.4.2 消化代謝酶指標

肝臟中脂肪酶（LPS）采用比濁法、胃蛋白酶（PPS）采用紫外分光光度法；肝臟和血漿中谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）采用賴氏法。血漿中葡萄糖（GLU）含量采用DNS 比色法測定，總膽固醇（TCHO）含量采用氧化酶法測定，甘油三酯（TG）含量采用甘油氧化酶法測定，總膽汁酸（TBA）含量采用循環(huán)酶速率法，組織中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮蘭法測定。各種酶指標和組織中蛋白質(zhì)含量檢測均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，血漿生化指標送秦皇島海港醫(yī)院檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗得出所有數(shù)據(jù)均使用SPASS17.0 分析軟件分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果表示為“平均值±標準差（Mean±SD.）”，若組間有顯著性差異，再使用Duncan's 法進行多重比較分析，顯著性水平為P＜0.05。

2 試驗結(jié)果

2.1 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆生長性能的影響（見表3）

表3 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆生長性能的影響

由表3可知，各試驗組增重率與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。各組間飼料系數(shù)、成活率、肝體比無顯著性差異（P＞0.05）；各試驗組肥滿度均高于對照組，且D4顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.2 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆組織成分的影響（見表4）

表4 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆體成分的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

由表4 可知，各組全魚粗蛋白、水分和背肌灰分無顯著差異（P＞0.05），D3、D4組全魚粗脂肪含量顯著高于D0、D1、D2組（P＜0.05）；D1、D3組背肌粗蛋白含量顯著高于其他組（P＜0.05），D3、D4組背肌粗脂肪含量分別顯著高于D1、D2組（P＜0.05）；D3、D4組肝臟粗脂肪含量分別顯著低于D1、D2組。

2.3 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆表觀消化率的影響（見表5）

表5 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆粗蛋白、粗脂肪和干物質(zhì)表觀消化率的影響(%)

由表5可知，D3、D4組蛋白質(zhì)、脂肪和干物質(zhì)的表觀消化率分別顯著高于D1、D2組（P＜0.05）且對照組顯著高于D1、D2組（P＜0.05）；D4組粗蛋白表觀消化率顯著高于D2組（P＜0.05）。

2.4 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆血漿中GLU、TCHO、TG和TBA的影響（見表6）

由表6可知，D3、D4組GLU、TCHO、TG含量分別顯著低于D1、D2組(P＜0.05)，各組TBA含量無顯著性差異(P＞0.05)。

2.5 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆肝臟脂肪酶和胃蛋白酶的影響（見表7）

由表7 可知，肝臟中D3、D4組脂肪酶活性與D0組無顯著性差異（P＞0.05），但D3組高于D1組（P＞0.05），D4組顯著高于D2組（P＜0.05），胃蛋白酶活性D3組顯著高于D1組，且D4組顯著高于D2組（P＜0.05）。

2.6 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆肝臟GOT、GPT的影響（見表8）

由表8可知，血漿中GOT和肝臟中GPT含量D3組顯著低于D1組，D4組顯著低于D2組（P＜0.05），對照組顯著低于D1、D2組（P＜0.05）；血漿中GPT中含量D3組低于D1組，D4組低于D2組，但差異不顯著（P＞0.05）；肝臟中GOT含量D3組低于D1組，D4組顯著低于D2組（P＜0.05）。

表6 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆血漿GLU、TCHO、TG和TBA的影響

表7 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆肝臟脂肪酶和胃蛋白酶指標的影響

表8 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆肝臟GOT、GPT指標的影響

3 討論

3.1 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆生長、組織成分以及粗蛋白、粗脂肪和干物質(zhì)表觀消化率的影響

在飼料中添加適量酶解肽對異育銀鯽生長和魚體成分無顯著影響[14]，還能降低其飼料成本。酶解肽在凡納濱對蝦飼料中替代魚粉比例過高時，會顯著降低全蝦粗脂肪含量[15]。孫建珍等[16]發(fā)現(xiàn)大菱鲆飼料中添加膽汁酸能夠提高其增重率，促進其對脂肪的消化吸收，顯著提高脂肪酶的活力。譚永剛等[17]、張玲等[18]、胡田恩等[19]在異育銀鯽、鯉魚、牛蛙上的研究均表明在飼料中添加膽汁酸能夠提高機體的生長性能、增重率和飼料利用率。以上研究結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。由肝臟粗脂肪含量、脂肪酶活性和粗脂肪的表觀消化率結(jié)果推測酶解肽替代魚粉比例過高時會導(dǎo)致肝臟脂肪增加而影響魚體內(nèi)膽汁酸的合成，進而影響魚體對脂肪的吸收利用，最后導(dǎo)致背肌脂肪沉積率顯著降低。添加膽汁酸兩組全魚、背肌粗脂肪含量顯著高于試驗組中未添加膽汁酸組，且肝臟脂肪低于未添加組（P＜0.05）。加入膽汁酸后提高了飼料脂肪利用率和飼料蛋白質(zhì)沉積率，增加了魚體背肌蛋白和脂肪累積。有研究顯示適量小肽添加到星斑川鰈幼魚日糧中能夠提高對蛋白質(zhì)的吸收利用，蛋白質(zhì)分解后的小肽可以直接被機體吸收利用，能夠增加蛋白吸收速度，所以小肽在蛋白質(zhì)代謝過程中有著不可或缺的作用[20-22]，也驗證了本試驗中低比例酶解肽替代魚粉組背肌粗蛋白高于其他組的結(jié)果。但是魚粉替代量過高時又會影響其生長的原因可能是酶解肽的替代量過高其本身存在的一些角蛋白不易吸收問題更加明顯，正好跟本試驗粗蛋白表觀消化率結(jié)果相一致。

3.2 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆血漿GLU、TCHO、TG和TBA和肝臟胃蛋白酶、脂肪酶的影響

本試驗結(jié)果顯示添加酶解肽和膽汁酸組顯著降低了血漿中GLU、TCHO、TG含量，且高比例肽加膽汁酸組肝臟中脂肪酶活性顯著高于高比例肽未添加膽汁酸組。單添加酶解肽組TCHO、TG 含量高于對照組，可能由于酶解肽的替代導(dǎo)致大菱鲆魚攝入的脂肪用于能量的消耗，脂肪分解后使血漿中TCHO、TG 含量升高，而魚體肌肉脂肪累積下降，而加入膽汁酸組顯著降低了血漿中TCHO、TG 含量，促進了脂肪在肌肉中的累積。由于魚體可能將脂肪分解為脂肪酸用于肌肉的氧化供能從而減少了GLU的利用，使血漿中GLU的含量有所積累。有研究發(fā)現(xiàn)[23]，飼料中添加膽汁酸能夠促進脂肪的乳化，活化脂肪酶，增強脂肪酶的活性。相同替代水平下添加酶解肽加膽汁酸組胃蛋白酶活性顯著高于單添加酶解肽組，與試驗結(jié)果粗蛋白表觀消化率相一致，說明酶解肽替代魚粉后加入膽汁酸有利于大菱鲆對蛋白質(zhì)的消化吸收。

3.3 酶解肽替代部分魚粉及補充膽汁酸對大菱鲆肝臟GOT、GPT的影響

GOT、GPT 為肝損傷程度的重要指標，GOT、GPT含量的不正常升高為肝損傷和肝炎發(fā)生的標志。張國安等[24]、黃炳山等[25]等研究表明，大菱鲆飼料中添加膽汁酸組血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量顯著低于未添加膽汁酸組，與本試驗結(jié)果相類似。說明酶解肽替代部分魚粉后加入膽汁酸能有效降低血漿中GOT、GPT含量，起到保護肝臟的作用。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，酶解肽替代部分魚粉后加入膽汁酸對大菱鲆生長性能、脂肪累積及消化代謝有一定的促進作用，因此酶解肽高比例替代魚粉蛋白飼料加入膽汁酸效果較好。