■翁俊杰 艾 蓉 傅玲琳 王彥波* 劉長軍

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310018；2.浙江象山縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江象山315700）

目前我國水產(chǎn)養(yǎng)殖正處于穩(wěn)定發(fā)展的階段，據(jù)報(bào)道，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量約占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%[1]，且規(guī)模仍在不斷擴(kuò)大。然而，傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式帶來的水產(chǎn)動(dòng)物安全隱患和養(yǎng)殖環(huán)境惡化引起了廣泛的關(guān)注。此外，抗生素及其他化學(xué)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中不合理使用和濫用引起的殘留和耐藥性現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了消費(fèi)者的食用安全，因此如何借助于新的技術(shù)手段，研究和開發(fā)新一代飼料和飼料添加劑成為研究的熱點(diǎn)。近年來隨著包括基因工程、酶工程、微生物工程等在內(nèi)的生物技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，水產(chǎn)動(dòng)物生物飼料逐漸成為飼料行業(yè)和生物飼料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢之一，目前關(guān)聯(lián)的水產(chǎn)動(dòng)物飼用益生菌、抗菌肽、酶制劑、飼料酵母、微藻、單細(xì)胞蛋白等均已逐漸用于水產(chǎn)養(yǎng)殖且取得了顯著的效果。隨著全球飼料行業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，蛋白資源的緊缺和環(huán)境保護(hù)的加強(qiáng)已成為制約相關(guān)行業(yè)發(fā)展的重要因素，依托現(xiàn)代生物技術(shù)并加快其在水產(chǎn)動(dòng)物生物飼料研究中的應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。

1 基因工程

1.1 基因工程與飼用益生菌

研究表明，飼用益生菌可以通過改變與養(yǎng)殖動(dòng)物相關(guān)的微生物群落，起到維護(hù)動(dòng)物胃腸道微生物群的生態(tài)平衡、保護(hù)其正常生理功能的作用，從而達(dá)到改善飼料利用率、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等目的，而且還能減少由抗菌藥物引起的動(dòng)物畸變和抗生素耐藥性等問題。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較多的益生菌種類包括乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌、芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌等。近年來，隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，逐漸應(yīng)用到飼用益生菌中，通過構(gòu)建工程菌的方法可以使之表達(dá)一些有用的外源基因，擴(kuò)大其生物學(xué)功能，從而達(dá)到一種制劑發(fā)揮多種功能的目的，而且還能增強(qiáng)益生菌的穩(wěn)定性。Santos 等[2]通過基因融合手段在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)了煙曲霉菌的植酸酶基因，構(gòu)建后的菌株不僅明顯減弱了植酸在斑馬魚飲食中的抗?fàn)I養(yǎng)作用，還促進(jìn)了斑馬魚的生長。Lin 等[3]同樣發(fā)現(xiàn)通過重組技術(shù)構(gòu)建的益生菌可以改善斑馬魚的營養(yǎng)代謝和肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，且對嗜水氣單胞菌和無乳鏈球菌的抵抗力也得到顯著增強(qiáng)。研究表明，飼料中添加能表達(dá)木聚糖酶基因的重組解淀粉芽孢桿菌R8，飼喂尼羅羅非魚60 d 后發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)與碳水化合物代謝相關(guān)的酶基因以及肝臟中的胰島素樣生長因子-1（Insulin like Growth Factor, IGF-1）基因的表達(dá)水平顯著升高，提高了飼料利用率和對嗜水氣單胞菌的抵抗力[4]?；蚬こ虘?yīng)用于飼用益生菌的安全性也引起了關(guān)注，Zhao 等[5]利用基因克隆技術(shù)從凝結(jié)芽孢桿菌中克隆了新型α-半乳糖苷酶，經(jīng)過蛋白質(zhì)活性和抗性分析，在揭示其顯著的蛋白酶抗性和高水解活性基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究證實(shí)了飼用安全性。

1.2 基因工程與飼用抗菌肽

由于抗菌肽在體內(nèi)的表達(dá)水平較低，且提取和純化既困難又昂貴，所以目前商業(yè)上的飼用抗菌肽主要是通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)。近年來隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，泥鰍、河豚、鱸魚、青蟹等水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽基因被克隆，為飼用抗菌肽的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加飼用抗菌肽可以顯著改善水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力和對疾病的抵抗力，最終促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育，He等[6]利用基因工程成功在小球藻中表達(dá)了重組抗菌肽Scy-hepc，體外和體內(nèi)的結(jié)果表明飼喂表達(dá)了抗菌肽的小球藻可顯著增強(qiáng)鯉魚對嗜水氣單胞菌的抵抗力。進(jìn)一步研究揭示不同的飼用抗菌肽抗菌機(jī)制有所不同。迄今研究證明飼用抗菌肽主要通過兩種途徑起作用，一種是抗菌肽與病原微生物細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合使膜的通透性發(fā)生改變，從而改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)容物外流導(dǎo)致細(xì)胞死亡；另一種是抗菌肽直接穿過細(xì)胞膜在細(xì)胞中發(fā)揮作用，抑制細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)，例如抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性、阻斷DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等。由此可見，抗菌肽與細(xì)胞膜的相互作用對于抗菌肽的功效至關(guān)重要，綜析國內(nèi)外的研究報(bào)道，目前主要存在三種肽-膜互作模型（圖1）。桶板模型（Barrel-stave）通過抗菌肽先在膜表面聚集，再以多聚體的形式插入膜雙分子層中，形成一個(gè)跨膜離子通道使細(xì)胞質(zhì)外流導(dǎo)致細(xì)胞死亡；環(huán)孔模型（Toroidal）則是通過抗菌肽插入膜中，借助于抗菌肽疏水端可以使膜疏水中心形成裂口，引起膜向內(nèi)彎曲形成一個(gè)直徑為1～2 nm 的環(huán)孔；第三種地毯模型（Carpet-like）是一種膜滲透模型，肽不是插入膜中而是在膜表面積聚，形成一個(gè)“地毯”覆蓋在膜表面，以“去垢劑”的作用方式破壞細(xì)胞膜而引起細(xì)胞死亡[7]。此外，研究人員也提出了一些其他肽-膜互作模型，如聚集體模型、分子電穿孔和“筏沉沒”模型等，這些對理解抗菌肽的抗菌機(jī)制也是重要的[7]。隨著對水產(chǎn)動(dòng)物各種抗菌肽結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，通過基因工程構(gòu)建新型的飼用抗菌肽成為未來研究的趨勢，如從河豚的皮膚黏液中提取純化并克隆了新型抗菌肽TpHAMP2，分析表明[8]該重組肽與天然肽具有相同的抗菌活性，這為飼用抗菌肽的商業(yè)化提供了可能。

圖1 抗菌肽作用機(jī)制模型

2 酶工程

2.1 酶工程與飼用效果

飼用酶制劑作為酶工程在飼料行業(yè)的應(yīng)用取得了顯著的效果，涉及飼用植酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶等，近五年酶制劑在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的研究參見表1。在水產(chǎn)飼料中添加適量的酶制劑可促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物對營養(yǎng)的吸收以改善生長性能。Li 等[9]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加175 mg/kg 蛋白酶可明顯提高飼料干物質(zhì)和蛋白質(zhì)的表觀消化率，且改善了生長性能，此發(fā)現(xiàn)在羅非魚、虹鱒魚和長鰭鯉中均有類似報(bào)道。有些植物性飼料原料中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，因此需要對酶進(jìn)行復(fù)配以彌補(bǔ)單一酶改善抗?fàn)I養(yǎng)因子的不足。楊航等[10]用由植酸酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶組成的復(fù)合酶制劑，有效降解了飼料中的植酸、果膠質(zhì)、β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高了草魚對蛋白質(zhì)、磷和干物質(zhì)的利用率。此外，酶制劑在飼料配伍加工過程中的作用時(shí)間以及與飼料中其他添加劑的相互作用也引起了關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料制粒和熟化過程中蛋白酶就已經(jīng)發(fā)揮了水解蛋白質(zhì)的作用，該蛋白酶經(jīng)過制粒和熟化過程后活性依然可保留79.3%和67.5%[9]。Zhu等[11]發(fā)現(xiàn)飼料中的檸檬酸可為植酸酶提供適宜的酸性環(huán)境來提高黃鯰魚對磷的利用率。Yao等[12]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加蛋白酶、糖酶和有機(jī)酸鹽可顯著提高太平洋白蝦的生長性能和飼料利用率，且三種添加劑的組合使用比單獨(dú)添加具有更顯著的效果。這為科學(xué)合理地設(shè)計(jì)包含飼用酶制劑在內(nèi)的生物飼料配方和配套生產(chǎn)工藝提供了理論依據(jù)。

表1 酶制劑在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用研究

2.2 酶工程與飼用機(jī)制

基于酶工程技術(shù)的酶制劑在水產(chǎn)動(dòng)物生物飼料中取得了顯著的應(yīng)用效果，這與酶制劑的生理活性具有顯著的關(guān)聯(lián)。酶制劑的飼用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：一是降解植物性飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善水產(chǎn)動(dòng)物對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用。研究發(fā)現(xiàn)添加植酸酶和蛋白酶可消除魚飼料中植酸、蛋白酶抑制劑和植物凝集素的抗?fàn)I養(yǎng)作用，顯著提高尼羅羅非魚對蛋白質(zhì)、磷、礦物質(zhì)和脂質(zhì)的利用率[20]。Castillo等[21]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。二是改善腸道結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)腸道菌群。Adeoye等[22]發(fā)現(xiàn)用復(fù)合酶制劑（植酸酶、蛋白酶和木聚糖酶）飼喂羅非魚可增加腸道微絨毛密度，且飼用前后腸道中變形桿菌和放線菌的菌落特征發(fā)生改變。在草魚的研究中也得到了類似的研究結(jié)果[10]。三是調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物的免疫能力。據(jù)報(bào)道，菠蘿蛋白酶可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫應(yīng)答、一氧化氮介導(dǎo)干擾素γ（Interferon-γ，IFN-γ）和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）[23]，而在木瓜蛋白酶上存在的酶促和非酶促位點(diǎn)都可以激活T 淋巴細(xì)胞和先天免疫反應(yīng)[24]。Choi等[19]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加混合蛋白酶喂養(yǎng)草魚后，其體內(nèi)相關(guān)免疫基因表達(dá)顯著增加，免疫力得到顯著改善。

3 微生物工程

3.1 微生物工程與飼用單細(xì)胞蛋白

單細(xì)胞蛋白（single cell protein, SCP）又稱為微生物蛋白。隨著蛋白資源緊張?jiān)诂F(xiàn)代飼料工業(yè)領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注，飼用酵母、細(xì)菌等SCP 均已逐漸應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中且取得顯著效果。其中細(xì)菌SCP 中蛋白含量可高達(dá)80%且易于培養(yǎng)，因此被認(rèn)為是最合適的SCP 生產(chǎn)來源。細(xì)菌主要是以碳?xì)浠衔锘蚣状甲鳛榈孜镞M(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)SCP，因此原料來源非常廣泛，一般的食品加工廢棄物和副產(chǎn)物等均能作為底物來綜合利用，這很大程度上減少了飼料的生產(chǎn)成本。目前SCP生產(chǎn)以固態(tài)發(fā)酵和液體深層發(fā)酵為主，其原料和菌種的多樣性使得在發(fā)酵生產(chǎn)過程中需要多種生物反應(yīng)模式以適合發(fā)酵菌種的增長（表2）。目前用于SCP 生產(chǎn)的細(xì)菌主要包括雙歧桿菌、乳酸菌、光合細(xì)菌、芽孢桿菌等，而一些新型的潛在菌種也在逐步研究中?，F(xiàn)已在魚類和蝦類上成功測試了幾種基于甲烷營養(yǎng)菌的SCP產(chǎn)品[25]。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氨棒桿菌SCP可以替代蝦飼料中10%～20%的魚粉[26]。Tlusty等[27]研究發(fā)現(xiàn)扭脫甲基桿菌SCP 可替代鮭魚飼料中55%的魚粉，在鱒魚飼料中可以替代魚粉10%[28]，而在蝦飼料中能夠完全替代魚粉[27]。此外借助于微生物工程技術(shù)的進(jìn)步，菌種發(fā)酵方式逐步由單一菌種趨向于復(fù)合菌株的協(xié)同發(fā)酵，通過不同菌種間的協(xié)同互補(bǔ)可生產(chǎn)產(chǎn)量更高、營養(yǎng)成分更齊全的SCP。孫立瑞等[29]發(fā)現(xiàn)在甲烷氧化菌培養(yǎng)中加入光合菌能夠明顯促進(jìn)甲烷氧化菌生長，且縮短了發(fā)酵周期，顯著提高了SCP 產(chǎn)量。Chumpol 等[30]在南美白對蝦飼料中添加了1%的兩種紫色非硫細(xì)菌SCP 混合物，蝦的生長性能、免疫力和存活率均得到顯著提高，且顯著優(yōu)于單一SCP。細(xì)菌和微藻的SCP 混合物在斑節(jié)對蝦上的研究結(jié)果同樣表明，SCP可安全替代蝦飼料中的魚粉和魚油[31]，且當(dāng)飼料中添加10%SCP 混合蛋白時(shí)就能夠加快生長速度[32]。

表2 不同反應(yīng)模式和微生物種類的比較優(yōu)勢[25]

3.2 微生物工程與飼用微藻

同樣，借助于微生物工程的飼用微藻也已成功用于水產(chǎn)動(dòng)物生物飼料中，涉及小球藻、螺旋藻、節(jié)旋藻等藻類。研究表明，飼用微藻通過富含的生物活性分子而發(fā)揮其生物學(xué)作用。如飼用微藻中富含的不飽和脂肪酸可有效改善養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)的脂肪酸譜[33]；飼用小球藻中的β-葡聚糖對魚類具有明顯的抗有害菌活性和免疫刺激活性；部分飼用微藻中的類胡蘿卜素可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基侵害，防止脂質(zhì)過氧化和維持重要免疫細(xì)胞、組織的結(jié)構(gòu)完整性，并促進(jìn)生長發(fā)育和提高存活率[33]；飼用微藻中蝦青素的抗氧化、抗高血脂作用可顯著改善魚蝦的健康狀況[34]，在以克氏原螯蝦[35]和金鯧魚[36]為研究對象的實(shí)驗(yàn)中均得到了驗(yàn)證。

此外，結(jié)合基因工程和微生物工程各自的優(yōu)勢，已逐步應(yīng)用于萊茵衣藻等飼用微藻開發(fā)中[33]，旨在增強(qiáng)飼用微藻的生物學(xué)作用，改善水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力、抗病性。已有研究證明，通過生物技術(shù)改良后可生產(chǎn)牛乳鐵蛋白抗菌肽的飼用微藻，可以顯著增加養(yǎng)殖魚體內(nèi)多不飽和脂肪酸和抗體含量，使魚體對細(xì)菌性腎臟疾病的免疫力得到增強(qiáng)[37]。近五年國內(nèi)外對飼用微藻種類及其在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用研究參見表3。

表3 飼用微藻種類及其在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用

4 展望

基因工程、酶工程、微生物工程等生物技術(shù)的應(yīng)用，為水產(chǎn)動(dòng)物生物飼料的開發(fā)提供了新的思路。目前飼用益生菌、抗菌肽、酶制劑、微藻等都已應(yīng)用于實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，但是由于相關(guān)作用機(jī)理還尚未完全研究清楚，尤其是缺乏在分子和細(xì)胞層面的深入研究，這很大程度上限制了在可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的靶向針對性應(yīng)用。剖析國內(nèi)外的相關(guān)研究，學(xué)科交叉下生物飼料與水產(chǎn)動(dòng)物互作機(jī)制的深入探究、微生境下各種益生因子關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、迅速發(fā)展的生物技術(shù)背景下可利用資源的拓展等已經(jīng)逐漸成為本領(lǐng)域未來發(fā)展的趨勢，可為水產(chǎn)動(dòng)物生物飼料的研發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為水產(chǎn)品安全生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境保護(hù)提供必要的保障。