張琴琴 周 莉 李 志 甘瑞海 俞兆曦 桂建芳 汪 洋

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所種子創(chuàng)新研究院, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072;2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所(有限公司), 銀川 750001)

生殖干細(xì)胞(Germline stem cells, GSCs)是一種獨(dú)特的成體干細(xì)胞, 具有自我更新的能力, 維持著配子的發(fā)生和分化, 在世代間傳遞遺傳信息, 被認(rèn)為是“不朽干細(xì)胞”[1,2]。因此, 鑒定分離GSCs, 不僅可作為研究成體干細(xì)胞自我更新和不對(duì)稱分裂、生殖細(xì)胞發(fā)育及其譜系穩(wěn)態(tài)維持的理想實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),而且對(duì)理解水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的繁殖策略、發(fā)展“借腹懷胎”等生物技術(shù)至關(guān)重要[3]。

nanos基因最早在果蠅中被鑒定為腹部形成的決定因子之一[4], 后被證實(shí)是維持GSCs所必需的[5]。脊椎動(dòng)物的nanos基因家族包括nanos1、nanos2和nanos3三個(gè)成員, 其中nanos2和nanos3是生殖細(xì)胞發(fā)育所必需的[6]。跟其他成員一樣,nanos2是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白, 含有一個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)域(Zinc Finger-domain, ZF-domain)。在模式魚類斑馬魚(Danio rerio)和青鳉(Oryzias latipes)中,nanos2被鑒定為GSCs的標(biāo)記基因[7—9]。隨后在少數(shù)養(yǎng)殖魚類,如虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[10]、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[11,12]、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[3]、半滑舌蹋(Cynoglossus semilaevis)[13]和大黃魚(Larimichthys crocea)[14]中進(jìn)行了nanos2的克隆和表達(dá)分析。但它們?cè)诔审w組織的分布以及性腺中的細(xì)胞定位都存在差異, 表現(xiàn)出物種的特異性。譬如,nanos2特異地在尼羅羅非魚雄性生殖細(xì)胞中表達(dá)[11,12]; 而斜帶石斑魚和半滑舌蹋的nanos2除了在精巢和卵巢中高表達(dá)外, 還在腦或肝臟等組織中微量表達(dá)[3,13]。在斜帶石斑魚的卵巢、精巢及間性性腺中,nanos2特異表達(dá)于一類直徑小于20 μm的細(xì)胞中[3], 與斑馬魚和青鳉的nanos2表達(dá)細(xì)胞類似, 可能是GSCs; 而虹鱒nanos2的轉(zhuǎn)錄本可在未分化A型精原細(xì)胞、卵原細(xì)胞和早期卵母細(xì)胞中檢測(cè)到[10]。

銀鯽(Carassius gibelio)是一種廣泛分布于亞歐大陸的六倍體魚類[15,16], 具有獨(dú)特的單性雌核生殖、有性生殖和類雜種生殖等多重生殖方式[15,17],其性別由雄性個(gè)體中額外的微小染色體決定, 并受溫度調(diào)控[18—20]。這些特性使其成為一種開展生殖發(fā)育遺傳學(xué)研究的獨(dú)特對(duì)象[21,22]。在前期的研究中, 本實(shí)驗(yàn)室已從銀鯽中鑒定了一些重要的生殖細(xì)胞標(biāo)記基因, 如vasa[23]、dazl[24]和dnd[25]等, 為研究單性脊椎動(dòng)物生殖方式的調(diào)控機(jī)制提供了重要線索, 但尚未鑒定到GSCs的標(biāo)記基因。因此, 本研究克隆鑒定了兩個(gè)歧化的nanos2基因Cgnanos2a和Cgnanos2b, 分析它們等位基因的多態(tài)性、基因組結(jié)構(gòu)和與其鄰近基因的共線性關(guān)系, 成體組織和卵巢不同發(fā)育階段的表達(dá)差異以及在卵巢和精巢中的細(xì)胞定位。研究結(jié)果一方面可為研究多倍體魚類重復(fù)基因的進(jìn)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 另一方面為分離銀鯽GSCs, 深入研究GSCs的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銀鯽F系取自中國科學(xué)院水生生物研究所官橋?qū)嶒?yàn)基地。取5月齡的銀鯽雌性個(gè)體的心、肝、脾、腎、腦、下丘腦、垂體和卵巢組織, 相同月齡雄性個(gè)體的精巢組織, 以及孵化后25d、35d、45d、60d、90d、120d和190d的銀鯽雌性個(gè)體的卵巢組織進(jìn)行qPCR分析, 進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)個(gè)體重復(fù)。取4月齡的銀鯽卵巢和精巢進(jìn)行RNA切片原位雜交分析。

1.2 總RNA提取和SMARTer cDNA模板合成

按照Trizol和SV Total RNA Isolation System試劑盒(Promega)說明書步驟進(jìn)行總RNA的提取, 其質(zhì)量和濃度分別用1.0% (w/v) 瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000C(Thermo Fisher Scientific)分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。銀鯽卵巢和精巢組織提取的總RNA等量混合后, 按照SMARTer?RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa)說明書描述的步驟構(gòu)建3′ 和5′ cDNA文庫。合成的cDNA置于-80℃保存。

1.3 銀鯽Cgnanos2a和Cgnanos2b cDNA全長克隆

首先在銀鯽F系基因組中進(jìn)行斑馬魚nanos2序列的同源搜索, 獲得兩個(gè)同源性較高的序列CI01000080_01993914_01996596和ENSDARP000000 89386-D3, 分別命名為Cgnanos2a和Cgnanos2b。接著, 根據(jù)Cgnanos2a和Cgnanos2b的基因組序列用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)RACE引物, 進(jìn)行了三輪擴(kuò)增(表 1)。以卵巢和精巢混合的cDNA文庫為模板,使用RACE引物Cgnanos2a-5′Outer、外Cgnanos2a-3′Outer、Cgnanos2b-5′Outer、Cgnanos2b-3′Out-er與引物UPM分別進(jìn)行5′和3′RACE的第一次PCR擴(kuò)增。接著將首次PCR產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板,用相應(yīng)的RACE內(nèi)引物Cgnanos2a-5′Inner1、Cgnanos2a-3′Inner1、Cgnanos2b-5′Inner1、Cgnanos2b-3′Inner1和引物NUP進(jìn)行巢式PCR, 電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物, 若無目的條帶或者條帶不單一, 將第二次PCR產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板, 再用相應(yīng)的RACE內(nèi)引物Cgnanos2a-5′Inner2、Cgnanos2a-3′Inner2、Cgnanos2b-5′Inner2、Cgnanos2b-3′Inner2和引物NUP進(jìn)行第二次巢式PCR, 三次PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均參見前期研究[26]。擴(kuò)增出的特異DNA帶經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳后, 采用Gel Extraction Kit(Omega Bio-Tek)回收, 回收產(chǎn)物與pMD18-T載體(TaKaRa)連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。選取陽性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序, 序列經(jīng)拼接后獲得Cgnanos2a和Cgnanos2b的cDNA全長序列。

表1 本文中所用引物Tab. 1 Primers used in this study

1.4 銀鯽Cgnanos2a和Cgnanos2b基因序列分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和其鄰近基因共線性分析

在ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)Cgnanos2a和Cgnanos2b的編碼氨基酸序列; NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載了7個(gè)物種的Nanos2的氨基酸序列; 采用BioEdit軟件進(jìn)行Nanos2多重序列比對(duì)分析; 用MEGA 6.06軟件, 采用鄰接法(NJ法)對(duì)脊椎動(dòng)物Nanos2進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。不同物種Nanos2的登錄號(hào)如下: 銀鯽CgNanos2a(MN864889)、銀鯽CgNanos2b-1(MN864890)、銀鯽CgNanos2b-2(MN864891)、銀鯽CgNanos2b-3(MN864892)、鯽(Carassius auratus)CaNanos2a(XP_026098184.1)、鯽CaNanos2b(XP_026068547.1)、鯉(Cyprinus carpio)CcNanos2a(XP_018956476.1)、鯉CcNanos2b(XP_018949587.1)、斑馬魚DrNanos2 (BK008580.1)、青鳉OlNanos2(NP_001153919.1)、石斑魚EcNanos2 (KX262962.1)、人(Homo sapiens)HsNanos2 (NP_001025032.1)和小鼠(Mus musculus)MmNanos2 (NP_918953.2)。

從銀鯽F系基因組和彩鯽基因組中獲得nanos2a和nanos2b的上下游基因序列, 并從Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得斑馬魚nanos2的上下游基因, 繪制nanos2及其周邊基因的共線性關(guān)系。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Reverse Transcription PCR, qPCR)

每個(gè)樣品取0.1 μg總RNA, 按照GoldScript cDNA合成試劑盒(Invitrongen)的說明書步驟反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)Cgnanos2a和Cgnanos2b基因的qPCR特異性引物(表 1)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)銀鯽最適內(nèi)參基因的分析[27], 選取真核翻譯延伸因子1α1-類似因子1(Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1-like1,eef1a1l1)作為內(nèi)參基因, 用CFX96TMOptics Module(Bio-Rad)進(jìn)行qPCR,反應(yīng)條件如下: 95℃預(yù)變性30s; 95℃變性5s, 60℃,30s, 40cycles; 65℃, 5s; 95℃, 5s。進(jìn)行3次生物學(xué)個(gè)體重復(fù), 并每個(gè)樣品做3次技術(shù)性重復(fù), 用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)來表示, 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差分析,P<0.05表示存在顯著性差異。

1.6 探針合成和原位雜交(Sections in situ hybridization, SISH)

根據(jù)Cgnanos2a和Cgnanos2b的cDNA序列, 設(shè)計(jì)原位雜交反義和正義引物, 5′端加入T7啟動(dòng)子序列(表 1)。探針的體外合成以及切片原位雜交均參照文獻(xiàn)[28]進(jìn)行。取4月齡銀鯽的卵巢和精巢組織,在4℃環(huán)境中于4% PFA中固定12—16h, 再經(jīng)30%蔗糖滲透過夜后, OTC包埋后進(jìn)行冰凍切片, 切片的厚度為5 μm。利用地高辛標(biāo)記的Cgnanos2a和Cgnanos2b的RNA探針進(jìn)行切片原位雜交。鏡檢染色達(dá)到合適效果后, 經(jīng)梯度甲醇脫色、復(fù)水和封片后,在Carl Zeiss正置熒光顯微鏡 Axio Imager M2 (中國科學(xué)院水生生物研究所分析測(cè)試中心)進(jìn)行拍片。

2 結(jié)果

2.1 銀鯽Cgnanos2a和Cgnanos2b的3個(gè)不同等位基因的分子特征

首先通過RACE-PCR各獲得了Cgnanos2a和Cgnanos2b的3個(gè)全長cDNA序列。其中Cgnanos2a的3個(gè)全長cDNA大小分別為752、753和758 bp, 它們之間高度保守, 序列平均一致性高達(dá)(98.9±0.3)%,且開放閱讀框均為438 bp, 預(yù)測(cè)編碼相同的145個(gè)氨基酸。Cgnanos2b的3個(gè)全長cDNA的大小分別為783、784和782 bp, 平均一致性為(99.5±0.1)%; 均編碼141個(gè)氨基酸(CgNanos2b-1、CgNanos2b-2和CgNanos2b-3), 它們之間的平均一致性為(99.1±0.4)%, 在第73和第85位氨基酸存在差異。而Cgnanos2a和Cgnanos2b序列分歧較大, 它們之間cDNA的平均一致性僅為(69.2±0.3)%, 氨基酸一致性為(79.1±0.7)%。

在四倍體鯽和鯉的基因組中也存在兩個(gè)分歧較大的nanos2基因(其中鯉nanos2在GenBank中被注釋為nanos homolog 1-like), 而在斑馬魚、青鳉、石斑魚等其他魚類和其他脊椎動(dòng)物基因組中, 均只搜索到一個(gè)nanos2基因。其中, 銀鯽Nanos2與鯽Nanos2高度保守, 其中CgNanos2a和CgNanos2b與CaNanos2a和CaNanos2b的一致性分別高達(dá)91.6%和82.7%。與其他鯉科魚類(如鯉和斑馬魚)Nanos2的一致性在72.1%—89.0%, 而與其他非鯉科魚類的一致性僅為40.0%左右。盡管銀鯽Nanos2與人、小鼠Nanos2的一致性在35.9%—37.3%, 但Nanos2的ZF結(jié)構(gòu)域在所有脊椎動(dòng)物中比較保守, 均具有半胱氨酸和組氨酸殘基組成的“CCHC CCHC”特征序列, 平均一致性為(75.6±14.4)%。

為了揭示銀鯽CgNanos2a和CgNanos2b的進(jìn)化關(guān)系和起源, 我們采用鄰接法(NJ法)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 1)。銀鯽CgNanos2b-1、CgNanos2b-2和CgNanos2b-3首先與鯽CaNanos2a聚為一簇, 再與鯉CyNanos2a聚為一簇; 同樣, 銀鯽CgNanos2b-1、Cg-Nanos2b-2和CgNanos2b-3與鯽CaNanos2b和鯉CyNanos2b聚為另一簇; 接著再與斑馬魚DrNanos2聚為鯉科魚類Nanos2一枝。上述的結(jié)果表明, 在銀鯽、鯽和鯉的進(jìn)化歷程中發(fā)生了一次異源多倍化事件, 導(dǎo)致在它們的基因組中產(chǎn)生了分歧較大的兩個(gè)nanos2基因。

圖1 NJ法構(gòu)建的脊椎動(dòng)物Nanos2的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 The phylogenetic tree of vertebrate Nanos2 based on NJ method分支上數(shù)值代表置信度, 設(shè)置1000 次bootstrap 進(jìn)行評(píng)估The values on the branches indicate the number of hits supporting the branching pattern from 1000 bootstraps

2.2 銀鯽Cgnanos2a和Cgnanos2b的基因組結(jié)構(gòu)和相鄰基因共線性

我們將擴(kuò)增獲得的Cgnanos2a和Cgnanos2b的全長cDNA序列與銀鯽基因組進(jìn)行比對(duì), 以分析它們的基因組結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明, 與其他脊椎動(dòng)物nanos2一樣,Cgnanos2a和Cgnanos2b也均由一個(gè)外顯子組成, 無內(nèi)含子。

接著, 根據(jù)Ensembl 數(shù)據(jù)庫獲得的nanos2所在區(qū)域的基因組序列, 我們繪制了銀鯽、鯽、斑馬魚nanos2及其上下游基因的共線性圖(圖 2)。Cgnanos2a和Cgnanos2b分別位于銀鯽A5和B5染色體上; 與斑馬魚相比, 銀鯽和鯽的nanos2a所在的A5染色體仍然保留著大多數(shù)基因, 具有保守的rsph4anapaa、selenow1-akap10-spata22-zgc:85789、apsaabr-nanos2-zswim7-adora2b-specc1-timm22等基因塊(Gene block), 但丟失了znf541-ehd2a、pho和tlcd3a; 其中znf541-ehd2a仍然保留在銀鯽和鯽nanos2b所在的B5染色體上, 表現(xiàn)出一定的“互補(bǔ)丟失”的特征。與A5染色體相比, B5丟失了更多重復(fù)基因, 如rsph4a、zgc:85789、abr和zswim7。與鯽的A5和B5染色體對(duì)上的基因相比, 銀鯽A5和B5染色體對(duì)保留著所有基因, 而在鯽的進(jìn)化歷程中丟失了tbcelb基因。與鯽的A5染色體相比, 銀鯽A5染色體僅有rsph4a發(fā)生了倒置; 而與銀鯽和鯽A5染色體以及鯽B5染色體相比, 銀鯽B5染色體nanos2鄰近區(qū)域發(fā)生了大片段倒置, 導(dǎo)致它們的轉(zhuǎn)錄起始方向全部發(fā)生改變。

2.3 銀鯽Cgnanos2a和Cgnanos2b在性腺中高豐度且偏向表達(dá)

鑒于Cgnanos2a和Cgnanos2b的3個(gè)不同等位基因之間的一致性非常高, 我們無法設(shè)計(jì)特異引物將它們等位基因分別擴(kuò)增。因此, 在本研究中我們針對(duì)Cgnanos2a和Cgnanos2b之間的序列差異, 設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異引物, 并采用qPCR方法分析了Cgnanos2a和Cgnanos2b在銀鯽F系成體組織中的分布以及在不同發(fā)育階段卵巢的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化(圖 3)。在5月齡銀鯽中,Cgnanos2a和Cgnanos2b主要在精巢中高表達(dá), 且呈現(xiàn)偏向表達(dá),Cgnanos2a的表達(dá)水平顯著高于Cgnanos2b(P<0.05)。其次在卵巢中可以檢測(cè)到較多的Cgnanos2a和Cgnanos2b的轉(zhuǎn)錄本, 但它們?cè)?月齡銀鯽卵巢中的表達(dá)豐度沒有明顯差別, 僅為精巢中Cgnanos2a的25.6%左右, 與Cgnanos2b的表達(dá)豐度相同。此外, 還可在下丘腦、垂體和腎臟等其他組織中檢測(cè)到少量Cgnanos2a和Cgnanos2b的轉(zhuǎn)錄本, 其中在肝臟、脾臟、腎臟、下丘腦和其他腦組織中Cgnanos2a和Cgnanos2b呈現(xiàn)偏向表達(dá)(圖 3A)。

隨后我們分析了它們?cè)诓煌殉舶l(fā)育階段的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明, 在孵化后25d,Cgnanos2a和Cgnanos2b的轉(zhuǎn)錄水平最高, 其中Cgnanos2a的轉(zhuǎn)錄水平是Cgnanos2b的6.5倍。隨后Cgnanos2a和Cgnanos2b的表達(dá)急劇下降。從孵化后25—60d,Cgnanos2a的表達(dá)量始終顯著高于同時(shí)期Cgnanos2b的表達(dá)量(P<0.05); 在孵化后90d后, 二者無顯著性差異(圖 3B)。

圖2 鯽復(fù)合種nanos2a和nanos2b基因與其鄰近基因保守的共線性關(guān)系Fig. 2 Syntenic alignment of chromosomal regions around Carassius auratus complex nanos2a and nanos2b

2.4 銀鯽Cgnanos2a和Cgnanos2b可標(biāo)記生殖干細(xì)胞

為了揭示Cgnanos2a和Cgnanos2b是由銀鯽卵巢和精巢組織的哪類細(xì)胞表達(dá), 我們合成了分別特異于Cgnanos2a和Cgnanos2b的地高辛探針, 并在4月齡銀鯽的卵巢和精巢組織切片中進(jìn)行了RNA原位雜交分析(圖 4)。4月齡的銀鯽卵巢組織處于卵母細(xì)胞初級(jí)生長期, 可觀察到大量卵原細(xì)胞和初級(jí)卵母細(xì)胞。原位雜交結(jié)果表明,Cgnanos2a和Cgnanos2b均特異地在鄰近生殖上皮的胞囊(Cyst)中一類直徑小于20 μm的細(xì)胞中表達(dá)(圖 4A、4B)。SISH的結(jié)果與qPCR的結(jié)果一致,Cgnanos2a和Cg-nanos2b在卵巢中的表達(dá)量沒有明顯差異, 不存在偏向表達(dá)。以Cgnanos2a為例, 在4月齡銀鯽卵巢組織切片中, 我們觀察到了僅含有1—4個(gè)Cgnanos2a陽性細(xì)胞的胞囊(圖 4C、4D), 含有2個(gè)Cgnanos2a陽性細(xì)胞和若干卵原細(xì)胞(Oogonia, Og)的胞囊(圖 4E)以及含有2個(gè)Cgnanos2a陽性細(xì)胞、若干卵原細(xì)胞和初級(jí)卵母細(xì)胞(Primary oocyte, PO)的胞囊(圖 4F)。

4月齡銀鯽精巢特征為含有精原細(xì)胞(Spermatogonia, SPG)、初級(jí)精母細(xì)胞(Primary spermatocyte, SPC1)和次級(jí)精母細(xì)胞(Secondary spermatocyte, SPC2), 尚未產(chǎn)生精子細(xì)胞(SPZ, Spermatozoa)。Cgnanos2a和Cgnanos2b的表達(dá)存在明顯的差異(圖 4G、4J)。與qPCR的結(jié)果一致(圖 3A),Cgnanos2a的表達(dá)水平高于Cgnanos2b。二者均可在精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞中檢測(cè)到, 但Cgnanos2a還在精小囊邊緣一類單個(gè)或兩個(gè)緊緊相鄰的細(xì)胞中高表達(dá)。

3 討論

在本研究中, 我們從銀鯽F系中克隆了nanos2的兩個(gè)部分同源基因Cgnanos2a和Cgnanos2b, 進(jìn)行了它們3個(gè)等位基因的序列特征和鄰近基因的共線性等進(jìn)化以及表達(dá)特征分析。自從nanos基因從果蠅中鑒定以來[4],nanos基因家族成員由于其在生殖細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用一直廣受關(guān)注[6,29,30]。至今,已在十余個(gè)物種中鑒定了nanos2, 并發(fā)現(xiàn)它在不同物種中的表達(dá)模式存在著明顯的差異。在人、小鼠和尼羅羅非魚中,nanos2均特異地在精巢中表達(dá),在卵巢和脾臟等其他組織中檢測(cè)不到轉(zhuǎn)錄本或蛋白的存在[6,12,31]。而Cgnanos2a和Cgnanos2b在銀鯽成體組織中的分布與牛[32]、雞[33]、斑馬魚[8]、青鳉[34,7]、虹鱒[10]、斜帶石斑魚[3]、半滑舌蹋[13]和大黃魚[14]相似, 除了在精巢中高豐度表達(dá)外, 還在卵巢中可以檢測(cè)到較高豐度或微量轉(zhuǎn)錄本的存在, 表明nanos2除了具有維持雄性生殖細(xì)胞的自我更新的功能外[6,35], 在這些物種的卵巢發(fā)育和再生中也具有重要作用[36]。

圖3 Cgnanos2a和Cgnanos2b在銀鯽不同成體組織(A)和不同發(fā)育階段卵巢(B)的表達(dá)分析Fig. 3 The expression of Cgnanos2a and Cgnanos2b in adult tissues (A) and ovaries at different developmental stages of gibel carp (B)

GSCs維持著生物體整個(gè)生命周期中配子的發(fā)生。nanos2已在小鼠[6]、斑馬魚[8]、青鳉[7]、虹鱒[10]和斜帶石斑魚[3]等物種中, 被鑒定為GSCs或未分化A型精原細(xì)胞的標(biāo)記基因。在本研究中, 我們通過SISH分析發(fā)現(xiàn)Cgnanos2a和Cgnanos2b均特異地在銀鯽卵巢鄰近生殖上皮的胞囊中一類直徑小于20 μm的細(xì)胞中表達(dá), 以及Cgnanos2a在精巢精小囊邊緣一類單個(gè)或兩個(gè)緊緊相鄰的細(xì)胞中高表達(dá)(圖 4)。這些nanos2陽性細(xì)胞的大小以及在性腺中的分布,與斑馬魚、青鳉和斜帶石斑魚的GSCs相似, 因此,我們推測(cè)nanos2可能是銀鯽GSCs的標(biāo)記基因。在孵化后25d的卵巢中,Cgnanos2a和Cgnanos2b的轉(zhuǎn)錄水平最高, 隨后表達(dá)水平急劇下降。這表明在孵化后25d左右或更早期, 銀鯽卵巢中的GSCs正在大量增殖。根據(jù)含有nanos2陽性細(xì)胞的胞囊內(nèi)含有細(xì)胞的類型和大小, 我們描述了銀鯽卵巢早期胞囊的發(fā)育過程(圖 4C—F)。最小的胞囊中一般僅含有一個(gè)Cgnanos2陽性細(xì)胞; 接著Cgnanos2陽性細(xì)胞經(jīng)過1—2次有絲分裂, 分裂成含有2—4個(gè)Cgnanos2陽性細(xì)胞; 隨著胞囊的發(fā)育, 一部分nanos2陽性細(xì)胞開始分化成不表達(dá)Cgnanos2的卵原細(xì)胞; 接著卵原細(xì)胞進(jìn)一步有絲分裂增殖, 并進(jìn)入減數(shù)分裂, 產(chǎn)生初級(jí)卵母細(xì)胞、次級(jí)卵母細(xì)胞和卵子。在人[31]和牛[32]等物種中,nanos2不僅局限于未分化A型精原細(xì)胞或精原干細(xì)胞中表達(dá), 還在其他雄性生殖細(xì)胞中, 如精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中表達(dá)。在本研究中,我們還在精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞中檢測(cè)到Cgnanos2a和Cgnanos2b的轉(zhuǎn)錄本, 但在次級(jí)精母細(xì)胞中沒有檢測(cè)到陽性信號(hào)。

擁有156條或162條染色體的銀鯽[37], 已被證明在其進(jìn)化歷程中除了經(jīng)歷硬骨魚類特異的全基因組復(fù)制(Teleost genome duplication, TGD)事件外[38—40], 還經(jīng)歷了額外的兩輪連續(xù)多倍化事件[41]。對(duì)銀鯽Dmrt1[41]、bmp15[26]、頭腎組織的轉(zhuǎn)錄組[42,43]以及干擾素系統(tǒng)基因的分析[27]均表明, 在銀鯽基因組中至少存在兩個(gè)歧化的部分同源基因。與前期的研究結(jié)果一致, 銀鯽也具有序列分歧較大的兩個(gè)部分同源基因Cgnanos2a和Cgnanos2b, 其cDNA序列的平均一致性僅為(69.2±0.3)%; 與Cgbmp15a和Cgbmp15b一樣[26],Cgnanos2a和Cgnanos2b各自具有高度保守的3個(gè)等位基因, 等位基因之間的一致性均高達(dá)99.0%。系統(tǒng)進(jìn)化樹和nanos2相鄰基因的共線性分析再次證明(圖 1和圖 2), 銀鯽進(jìn)化歷程中發(fā)生了額外的兩輪多倍化事件, 是一個(gè)異源六倍體。其中異源多倍化事件導(dǎo)致銀鯽和鯽的四倍體共同原始祖先的基因組中包含Cgnanos2a和Cgnanos2b; 隨后的同源多倍化事件導(dǎo)致Cgnanos2a和Cgnanos2b各自具有了序列高度一致性的3個(gè)等位基因。

圖4 Cgnanos2a和Cgnanos2b在銀鯽卵巢和精巢中的細(xì)胞定位Fig. 4 Cellular distribution of Cgnanos2a and Cgnanos2b in gibel carp ovary and testis

新形成的多倍體在經(jīng)歷“基因組休克(Genomic shock)”的混亂后[44,45], 發(fā)生一系列復(fù)雜的、非孟德爾的基因組變化來突破不穩(wěn)定的瓶頸, 重建多倍體基因組。這些變化包括染色體重排和染色質(zhì)重構(gòu)[46,47], 基因轉(zhuǎn)換、部分同源基因的丟失、沉默或偏向表達(dá)[48,49], 表觀遺傳重塑[50,51]以及亞基因組的轉(zhuǎn)錄表達(dá)響應(yīng)和基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的改變等[52,53]。相對(duì)于斑馬魚nanos2的鄰近基因分布, 銀鯽和鯽的nanos2a所在的A5染色體保留著大多數(shù)的基因, 而nanos2b所在的B5染色體丟失了更多基因, 表現(xiàn)出一定的“互補(bǔ)丟失”的特征; 且與銀鯽和鯽A5染色體以及鯽B5染色體相比,nanos2鄰近區(qū)域發(fā)生了大片段倒置, 導(dǎo)致它們的轉(zhuǎn)錄起始方向全部發(fā)生改變(圖 2)。同時(shí), 盡管在成體組織分布、不同發(fā)育階段卵巢中,Cgnanos2a和Cgnanos2b具有相似的表達(dá)譜式, 但在5月齡精巢、肝臟、脾臟、腎臟、下丘腦和其他腦組織, 以及在孵化后25—60d的卵巢中,Cgnanos2a的表達(dá)水平均顯著高于Cgnanos2b的表達(dá)水平(圖 3); 而且在精巢中,Cgnanos2a還在精小囊邊緣一類單個(gè)或兩個(gè)緊緊相鄰的細(xì)胞中高表達(dá)(圖 4G—J)。上述的結(jié)果表明, 銀鯽在形成異源多倍體后, 其基因組發(fā)生了大片段的倒置、不同來源的兩個(gè)部分同源基因的丟失和偏向表達(dá)等復(fù)雜變化。