易紹金，邱思語，余 燦，2

（1.長江大學化學與環(huán)境工程學院，湖北荊州 434023；2.中石化江漢石油工程設計有限公司，湖北武漢 430200）

產(chǎn)甲烷菌（methane-producing bacteria，簡稱MPB）是一類能夠?qū)o機或有機化合物厭氧發(fā)酵轉化成甲烷等的古細菌［1-3］。它是微生物采油功能菌之一［4-8］，也被應用于污泥厭氧消化過程中［9-10］，是廢水生物處理的重要菌群［11-12］，同樣也是沼氣發(fā)酵的主要菌群［13-16］。因此，在微生物采油（microbial enhanced oil recovery，簡稱MEOR）尤其是本源微生物采油研究和應用、廢水厭氧生物處理及沼氣發(fā)酵領域等工作過程中常常需要測定MPB 的菌量。目前主要采用Hungate 滾管培養(yǎng)法測定MPB 菌量，采用該法測試需要嚴格的厭氧無菌環(huán)境和特殊的實驗裝置——滾管機，但滾管機操作繁瑣、費時、效率低下，而且計數(shù)采用活菌計數(shù)法存在計數(shù)不準、讀數(shù)不精確的明顯缺陷。目前的MPB 菌量測定的工作效率極低，需要一定的操作技術和操作條件，不能滿足現(xiàn)代高效工作的需要，因此，需要研制一種快速方便且準確的MPB菌量的新方法、新工具。

1989年，孫炳德［17］使用細菌瓶法測定了硫酸鹽還原菌（SRB）的菌量，認為細菌瓶法是一種高效、準確的測定菌量的一種方法。隨后易紹金［18-20］將細菌瓶法應用于測定石油烴降解菌、產(chǎn)表面活性劑菌、黃原膠降解菌等細菌的菌量，擴大了細菌瓶法測定細菌的種類和范圍。國內(nèi)早已采用了既簡便又準確的細菌測試瓶法，如北京華興化學試劑廠生產(chǎn)的SRB 細菌測試瓶，細菌瓶內(nèi)裝有SRB 專用培養(yǎng)基，但只能用于測定SRB 而不能用于測定MPB。由于MPB 測定需要嚴格的厭氧環(huán)境，且滾管機不易攜帶，Hungate滾管培養(yǎng)法不適用于現(xiàn)場測定，改進方法大多數(shù)以滾管機為基礎，測定條件苛刻，目前仍沒有一種較好的測定MPB 菌量的方法。為了更加方便且易于測定MPB的菌量，本文根據(jù)細菌瓶法的基本原理，研制了用于培養(yǎng)MPB的專用測試瓶，內(nèi)含有MPB的專用培養(yǎng)基，并進行了許多樣品的實際測試。

1 實驗部分

1.1 儀器

STARTER3100 型pH 計，奧豪斯儀器設備有限公司；SPX-300BS-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；YM 型不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；R05型厭氧培養(yǎng)滾管機，北京豐美儀器公司；螺口厭氧培養(yǎng)管，1.0 mL一次性無菌注射器，山東威高集團高分子制品股份有限公司。

1.2 MPB測試瓶的制備

（1）MPB培養(yǎng)液的配制。通過比較不同配方培養(yǎng)液培養(yǎng)MPB 的生長速度優(yōu)選培養(yǎng)液配方，反復篩選得到了以低分子有機酸鹽［21，22］為碳源，含有銨鹽、磷源和化學脫氧劑等組分的專門用于培養(yǎng)MPB 的培養(yǎng)液配方及其合適的pH 值。該培養(yǎng)基的配方是按照MPB 的生理生化特性所設計，所培養(yǎng)的細菌只是在厭氧條件下將低分子有機酸裂解為甲烷等的MPB［21-22］，測試工作不會受其它細菌的干擾。

（2）生長指示。為了及時準確地反映培養(yǎng)液中有無MPB 的生長，必須確定易于觀察的生長指示，要求生長指示特異性強，易于判斷。根據(jù)MPB代謝特點和代謝產(chǎn)物確定其生長指示。MPB 的正常生命代謝會讓培養(yǎng)液變渾濁，在厭氧條件下會將低分子有機酸裂解為甲烷等，即培養(yǎng)液變渾濁并且有氣泡即為MPB的生長指示［23］。

（3）測試瓶制備與滅菌。將配制好的培養(yǎng)液在厭氧培養(yǎng)箱中分裝入標準玻璃瓶（15 mL）中，每瓶裝9.0 mL 培養(yǎng)液，然后進行橡膠蓋和鋁蓋封口，再按常規(guī)滅菌，即成為MPB測試瓶。

1.3 測試方法

具體測定方法按細菌瓶常規(guī)測定方法進行［18-20］。把接種后的測試瓶放在30℃或現(xiàn)場溫度±5℃［24］培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，無MPB存在的測試瓶內(nèi)培養(yǎng)液無明顯變化，而有MPB存在的測試瓶內(nèi)培養(yǎng)液會逐漸變渾變濁并出現(xiàn)肉眼可見的氣泡，一般此過程為14 d，因此確定14 d讀數(shù)。

1.4 計數(shù)

MPB 菌量的測定一般采用二次平行管測定方法［24］，可根據(jù)表1 進行計數(shù)。實際樣品測定時需乘以稀釋倍數(shù)。

表1 二次平行管的細菌最大可能值

2 結果與討論

為了驗證細菌瓶法測定MPB 的準確性和可靠性，采用了工業(yè)化生產(chǎn)的MPB測試瓶測定某油田采出液、某微生物采油菌劑、某污水處理廠厭氧消化池等樣品中的MPB 菌量，并與Hungate 滾管培養(yǎng)法測定結果進行對比，選擇具有代表性的3 個測定結果分別列于表2、表3和表4。

表2 某油田采出液中MPB測定結果（二次平行）

表3 某微生物采油菌劑中MPB測定結果（二次平行）

表4 污水處理廠厭氧消化池中MPB測定結果（二次平行）

由表2數(shù)4 可見，細菌瓶法的測定結果與Hungate 滾管培養(yǎng)法基本相同，表明其測試結果是準確可靠的。在表4中，可能是Hungate滾管培養(yǎng)法在除氧階段混入了少量的氧氣，沒有形成完全厭氧的環(huán)境，導致Hungate 滾管培養(yǎng)法測定MPB 數(shù)量少于細菌瓶法，更能證明細菌瓶法的測試結果是可靠的。

3 結論

細菌瓶法可準確測定樣品中的MPB的菌量，可用于微生物采油（MEOR）研究尤其是依靠本源微生物提高原油采收率、廢水厭氧生物處理及沼氣發(fā)酵等領域。與傳統(tǒng)的Hungate 滾管培養(yǎng)法相比，細菌瓶法測定MPB數(shù)量具有生長指示明顯，操作極為簡單，可大大提高工作效率等優(yōu)點，值得推廣應用。