嚴(yán) 瑞， 楊雨星， 劉玲伶， 王圓圓， 陳 燁， 郭 兵△

（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1腎內(nèi)科，2內(nèi)分泌與代謝病科，貴州貴陽(yáng)550004；3貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025）

第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是人類(lèi)第10號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有雙重特異性磷酸酶的抑癌基因［1］，它編碼具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的雙重特異性磷酸酶，可通過(guò)作用于下游信號(hào)通路影響腫瘤的發(fā)生［2］。但近年來(lái)研究表明，PTEN除與腫瘤相關(guān)外，其表達(dá)變化在多個(gè)組織纖維化的發(fā)生中也起到了重要作用［3-4］。我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在糖尿病腎組織及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中是減少的［5］，且PTEN的減少與腎纖維化及細(xì)胞自噬有著密切的關(guān)系［6-7］。此外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也分別在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）、糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）等多種疾病所誘導(dǎo)的腎組織纖維化模型中進(jìn)行了觀察，對(duì)PTEN表達(dá)變化與系膜細(xì)胞增殖、足細(xì)胞損傷的關(guān)系進(jìn)行了研究，并得到了類(lèi)似的結(jié)論［8-11］。由此可見(jiàn)，在糖尿病腎病及其他腎臟疾病中，PTEN表達(dá)變化與腎臟病變進(jìn)展之間有著密切的聯(lián)系。但是，在DN進(jìn)展過(guò)程中PTEN的表達(dá)減少是受到哪些因素的調(diào)控目前并未完全闡明。

在腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）綁定在PTEN的上游，參與對(duì)PTEN表達(dá)的調(diào)控［12］。但是，PPARγ是具有組織及疾病特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在不同的組織及不同疾病中的作用不盡相同，而且糖尿病是與腫瘤從發(fā)病機(jī)理到病理改變完全不同的兩種疾病。因此在糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中，PPARγ對(duì)PTEN的mRMA及蛋白表達(dá)水平有何影響，這種影響對(duì)下游的信號(hào)通路及腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（即上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，epithelial-mesenchymal transition，EMT）將產(chǎn)生何種作用，是否會(huì)減輕小管間質(zhì)纖維化的病變，目前均不清楚，還缺乏系統(tǒng)的研究。

基于此，我們應(yīng)用高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用過(guò)表達(dá)及敲減PPARγ基因表達(dá)的方法來(lái)干預(yù)NRK-52E細(xì)胞，研究PPARγ對(duì)PTEN的調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)而對(duì)PPARγ如何通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)變化來(lái)調(diào)控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）/黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）信號(hào)通路及影響細(xì)胞EMT的機(jī)制進(jìn)行探討。

材料和方法

1 材料與試劑

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM正常糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）、DMEM高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為25.0 mmol/L）和胰蛋白酶（Gibco）；兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋公司）；牛血清白蛋白（北京索萊寶）；二甲基亞砜和二硫蘇糖醇（北京鼎國(guó)昌盛公司）；Trizol Reagent（Invitrogen）；Western blot細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制劑、I抗稀釋液、Triton X-100、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL顯色劑和抗熒光淬滅封片液（北京碧云天生物研究所）；蛋白酶磷酸酶抑制劑（上?？党缮锕荆?.45μm PVDF膜和Whatman 3 mm濾紙（Millipore）；蛋白質(zhì)marker、總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit）和2× Taq PCR MasterMix（北京天根公司）；逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR試劑（廣州銳博生物公司）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）；iQTMSYBR Green Supermix（Bio-rad）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（上海生物工程公司）；mouse anti-β-actin及生物素標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG（普美生物）；rabbit anti-PPARγ、rabbit antiphospho-AKT（Thr308）和 rabbit anti-phospho-FAK（Tyr397）antibodies（CST）；rabbit anti-PTEN、rabbit anti-E-cadherin、mouse anti-α-SMA、rabbit anti-vimentin、rabbit anti-AKT1和 rabbit anti-FAK antibodies（Abcam）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK52E（中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)），在37℃及5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。MTT法檢測(cè)羅格列酮及GW9662對(duì)NRK52E細(xì)胞活力的影響，并計(jì)算最合適的藥物干預(yù)濃度。為了構(gòu)建PPARγ和PTEN過(guò)表達(dá)及敲減的質(zhì)粒載體，首先在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)查詢PPARγ基因序列（NM_001145367.1）及PTEN基因序列（NM_031606），過(guò)表達(dá)及shRNA序列由山東維真生物有限公司構(gòu)建。轉(zhuǎn)染試劑用的是Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作。待NRK-52E細(xì)胞融合至50%～60%時(shí)，轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒，細(xì)胞培養(yǎng)48 h。根據(jù)不同的干預(yù)措施，細(xì)胞隨機(jī)分為正常糖（normal glucose，NG）組（2%FBS+DMEM+5.5 mmol/L glucose）、高 糖（high glucose，HG）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose）、HG+PPARγ 空 載 體（GFP）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+GFP）、HG+PPARγ過(guò) 表 達(dá)（GFP-PPARγ）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+GFP-PPARγ）、HG+PPARγ shRNA空載體（control shRNA）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+control shRNA）、HG+PPARγ shRNA組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+PPARγ shRNA）、GW9662組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+GFP+5μmol/L GW9662）、GW9662+過(guò)表達(dá)PTEN（GFPPTEN）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+GFPPTEN+5μmol/L GW9662）、羅格列酮組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+control shRNA+5μmol/L羅格列酮）和羅格列酮+PTEN shRNA組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+PTEN shRNA+5μmol/L羅格列酮）。上述各組細(xì)胞分別處理至60 mm培養(yǎng)皿中，48 h后收集細(xì)胞供各檢測(cè)指標(biāo)的進(jìn)行（包括細(xì)胞免疫熒光、Western blot及RT-qPCR）。

2.2 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞爬片，進(jìn)行相應(yīng)處理48 h后；棄去培養(yǎng)基后，無(wú)菌的細(xì)胞用PBS洗凈6孔板；4%多聚甲醛于37℃固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；10%BSA于37℃孵育30 min；用1%BSA稀釋特異性抗體（PPARγ和PTEN抗體均1∶50稀釋），于4℃孵育過(guò)夜；次日，取出6孔板至室溫，放置30 min；將復(fù)溫后的6孔板用PBS洗滌3次，每次5 min，滴加1%BSA稀釋的II抗（1∶800），于37℃中避光孵育30 min，隨后PBS洗滌3次，每次5 min；避光滴加即用型DAPI，室溫5 min，隨后PBS洗滌3次，每次5 min；抗熒光淬滅劑封片液封片；倒置熒光顯微鏡下觀察并攝取圖像。蛋白表達(dá)部位出現(xiàn)綠色熒光物質(zhì)為陽(yáng)性，陰性對(duì)照片無(wú)熒光物質(zhì)出現(xiàn)。

2.3 Western blot檢測(cè)蛋白水平 各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，加入細(xì)胞裂解液后刮取細(xì)胞提取總蛋白，或提取細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白。按BCA法試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)需要配制濃度不同的分離膠，室溫下靜置約30 min（待其凝固）后灌入5%的濃縮膠，插入梳齒靜置30 min后待用；取適量樣本經(jīng)SDS-PAGE分離出分子量大小不同的各蛋白（電壓大小及時(shí)間據(jù)目的蛋白分子量而定）；預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜儀中，穩(wěn)流將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上（電流大小及時(shí)間據(jù)目的蛋白分子量而定）；5%脫脂奶粉室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；I抗稀釋液稀釋各特異性抗體［E-cadherin、α-SMA、vimentin、PPARγ、PTEN、AKT1、p-AKT（Thr308）、FAK和p-FAK（Tyr397）抗體均1∶1 000稀釋］，于4℃搖床慢搖孵育過(guò)夜；次日，TBST洗膜3次，加入1%脫脂奶粉的TBST稀釋的II抗（1∶7 000），室溫下慢搖孵育1 h；TBST洗滌5 min×3次，TBS洗滌5 min；ECL發(fā)光液顯色后曝光；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描、Quantity One軟件分析后，得到各條帶的灰度值（β-actin作為內(nèi)參照），算出目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

3.4 RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，參照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞總RNA。將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。iQ?SYBR?Green Supermix行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL［2×SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 μL，無(wú)RNA酶水6μL，上、下游引物各1μL，cDNA 2μL］。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性10 s，60℃退火30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)后，65℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值，以 β-actin/U6為內(nèi)參照，用 2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對(duì)含量）。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。所用引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。PPARγ的正向引物序列為5′-CGCAGCCTCAGCCAAGAC-3′，反向引物序列為5′-TGGGGAGAGAGGACAGATGG-3′；PTEN的正向引物序列為5′-CAATGTTCAGTGGCGGAACTT-3′，反向引物序列為 5′-GGCAATGGCTGAGGGAACT-3′。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 19.0、GraphPad Prism 5和 Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且通過(guò)方差齊性檢驗(yàn)。兩組數(shù)據(jù)差異的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 過(guò)表達(dá)PPARγ后NRK-52E細(xì)胞內(nèi)PPARγ、PTEN及EMT相關(guān)指標(biāo)變化

應(yīng)用過(guò)表達(dá)PPARγ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞株，并在高糖條件下培養(yǎng)，免疫熒光、Western blot及RT-qPCR檢測(cè)PPARγ和PTEN及EMT相關(guān)因子mRNA及蛋白表達(dá)的變化。RT-qPCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PPARγ后，PPARγ的mRNA表達(dá)增加，PTEN的mRNA表達(dá)也隨之增加（P＜0.05），見(jiàn)圖1。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，PPAR過(guò)表達(dá)組的PPARγ及PTEN熒光強(qiáng)度明顯高于空載體對(duì)照組，見(jiàn)圖2。Western blot結(jié)果顯示，PPARγ過(guò)表達(dá)組的PPARγ及PTEN蛋白表達(dá)水平明顯高于空載體對(duì)照組，E-cadherin的表達(dá)明顯上調(diào)，而vimentin和α-SMA的蛋白水平顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖3、4。

Figure 1.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of PPARγ and PTEN in each group.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs GFP group.圖1 RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)PPARγ質(zhì)粒后NRK-52E細(xì)胞中PPARγ和PTEN的mRNA表達(dá)

Figure 2.The protein expression of PPARγ and PTEN in cultured NRK52E cells after transfection with GFP-PPARγ was observed by immunofluorescence staining（×400）.圖2 免疫熒光染色觀察轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)PPARγ質(zhì)粒后NRK52E細(xì)胞中PPARγ和PTEN的蛋白表達(dá)

Figure 3.Western blot was used to determine the protein expression of PPARγ and PTEN in cultured NRK52E cells after transfection with GFP-PPARγ.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs GFP group.圖3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)PPARγ質(zhì)粒后NRK52E細(xì)胞中PPARγ和PTEN蛋白表達(dá)的變化

Figure 4.Western blot was used to determine the protein expression of E-cadherin，vimentin and α-SMA in cultured NRK52E cells after transfection with GFP-PPARγ.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs GFP group.圖4 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)PPARγ質(zhì)粒后NRK52E細(xì)胞中E-cadherin、vimentin和α-SMA的蛋白表達(dá)

2 敲減PPARγ后，NRK-52E細(xì)胞PPARγ、PTEN及EMT相關(guān)指標(biāo)的變化

應(yīng)用PPARγ shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞株，并在高糖條件下培養(yǎng)，應(yīng)用免疫熒光、Western blot及RT-qPCR檢測(cè)PPARγ和PTEN及EMT相關(guān)因子mRNA及蛋白表達(dá)的變化。RT-qPCR結(jié)果顯示，敲減PPARγ后，PPARγ的mRNA表達(dá)顯著降低，PTEN的mRNA表達(dá)也隨之減少（P＜0.05），見(jiàn)圖5。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，PPARγ敲減組的PPARγ及PTEN熒光強(qiáng)度明顯弱于空載對(duì)照組，見(jiàn)圖6。Western blot結(jié)果顯示，PPARγ敲減組的PPARγ及PTEN蛋白表達(dá)水平明顯低于空載對(duì)照組，E-cadherin的表達(dá)明顯下調(diào)，而vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖7、8。

3 PPARγ抑制劑GW9662處理并過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)AKT、p-AKT、FAK和p-FAK蛋白水平的影響

Figure 6.The protein expression of PPARγ and PTEN in cultured NRK52E cells after transfection with PPARγ shRNA was observed by immunofluorescence staining（×400）.圖6 免疫熒光染色觀察轉(zhuǎn)染PPARγ shRNA質(zhì)粒后NRK52E細(xì)胞中PPARγ和PTEN的蛋白表達(dá)

Figure 5.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of PPARγ and PTEN in the NRK52E cells.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control shRNA group.圖5RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染PPARγ shRNA質(zhì)粒后NRK52E細(xì)胞中PPARγ和PTEN mRNA表達(dá)的變化

與高糖組相比，GW9662組PTEN的蛋白水平降低，而p-AKT（Thr308）、FAK及p-FAK（Tyr397）的蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）；與GW9662組相比，GW9662+過(guò)表達(dá)PTEN組PTEN的蛋白水平明顯增高，并伴隨p-AKT（Thr308）、FAK及p-FAK（Tyr397）的蛋白水平降低（P＜0.05）；而AKT在各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖9。

Figure 7.Western blot was used to determine the protein expression of PPARγ and PTEN in cultured NRK52E cells after transfection with PPARγ shRNA.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control shRNA group.圖7 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染PPARγ shRNA質(zhì)粒后NRK52E細(xì)胞中PPARγ和PTEN蛋白表達(dá)的變化

Figure 8.Western blot was used to determine the protein expression of E-cadherin，vimentin and α-SMA in cultured NRK52E cells after transfection with PPARγ shRNA.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control shRNA group.圖8 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染PPARγ shRNA質(zhì)粒后NRK52E細(xì)胞中E-cadherin、vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)的變化

Figure 9.Western blot was used to determine the protein levels of AKT，p-AKT，F(xiàn)AK and p-FAK in the NRK-52E cells with GW9662 treatment and over-expression of PTEN.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs HG group；*P＜0.05 vs GW9662 group.圖9Western blot檢測(cè)GW9662處理并過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)AKT、p-AKT、FAK和p-FAK蛋白水平的影響

4 PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮處理并敲減PTEN對(duì)AKT、p-AKT、FAK和p-FAK蛋白水平的影響

與高糖組相比，羅格列酮組PTEN的蛋白水平增高，而p-AKT（Thr308）、FAK和p-FAK（Tyr397）的蛋白水平降低（P＜0.05）；與羅格列酮組相比，羅格列酮+PTEN shRNA組PTEN的蛋白水平降低，相應(yīng)的p-AKT（Thr308）、FAK和p-FAK（Tyr397）的蛋白水平增高（P＜0.05）；AKT在各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖10。

討 論

本課題組前期研究顯示，PTEN在糖尿病條件下的表達(dá)是減少的，且PTEN通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬而參與調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞的EMT［5-7］。但是，是何種原因?qū)е铝薖TEN的表達(dá)減少目前并未完全闡明，這需要從對(duì)PTEN具有調(diào)控作用的信號(hào)分子來(lái)進(jìn)行探討。Bonofiglio等［12］在腫瘤中研究了PTEN的啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)PPARγ綁定在PTEN的上游，與其上游的PPRE1和PPRE2兩個(gè)反應(yīng)元件結(jié)合，參與對(duì)PTEN表達(dá)的調(diào)控。但也有研究提示，PPARγ在惡性腫瘤中的表達(dá)具有疾病和組織特異性，不同病變組織中PPARγ的作用可能不同［13-15］。同樣，在DN發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腎小管上皮細(xì)胞PPARγ表達(dá)的變化及其是否對(duì)PTEN表達(dá)具有調(diào)控作用目前并不清楚，需要研究明確。

Figure 10.Western blot was used to determine the protein levels of AKT，p-AKT，F(xiàn)AK and p-FAK in the NRK-52E cells with rosiglitazone treatment and knockdown of PTEN.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs HG group；*P＜0.05 vs rosiglitazone group.圖10 Western blot檢測(cè)羅格列酮處理并敲減PTEN對(duì)AKT、p-AKT、FAK和p-FAK蛋白水平的影響

有學(xué)者在對(duì)結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株等研究中發(fā)現(xiàn)羅格列酮可通過(guò)上調(diào)PTEN蛋白和mRNA的表達(dá)，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16-18］。GW9662是PPARγ阻斷劑，目前有關(guān)GW9662與腎間質(zhì)纖維化的研究報(bào)道較少。Liu等［19］發(fā)現(xiàn)，GW9662能顯著上調(diào)體外培養(yǎng)的多囊腎細(xì)胞TGF-β1表達(dá)，誘導(dǎo)膠原和FN聚集。Kusunoki等［20］報(bào)道，GW9662通過(guò)增加 UUO小鼠腎臟組織TGF-β1的表達(dá)而顯著加重腎間質(zhì)的病變和纖維化程度［20］。

但是無(wú)論是PPARγ的激動(dòng)劑還是抑制劑，其本身并不影響PPARγ的表達(dá)，因此，并未充分證明PPARγ表達(dá)變化對(duì)PTEN會(huì)產(chǎn)生何種影響。另外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑可以不依賴于PPARγ而產(chǎn)生相應(yīng)作用［21］。因此，我們?cè)撗芯坎捎眠^(guò)表達(dá)和敲減PPARγ基因的方法，研究在PPARγ表達(dá)變化時(shí)將會(huì)對(duì)PTEN產(chǎn)生何種影響。研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PPARγ后，PTEN蛋白及mRNA升高，反應(yīng)細(xì)胞EMT的指標(biāo)E-cadherin的表達(dá)明顯上調(diào)，而vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)；敲減PPARγ后，PTEN的蛋白及mRNA表達(dá)明顯減少，反應(yīng)細(xì)胞EMT的指標(biāo)E-cadherin的表達(dá)明顯下調(diào)，而vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高，該結(jié)果證實(shí)了在高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中，PPARγ的表達(dá)變化能調(diào)控PTEN的表達(dá)，且對(duì)蛋白及mRNA表達(dá)均有影響，說(shuō)明PPARγ是從轉(zhuǎn)錄水平影響了PTEN的表達(dá)。因此推測(cè)，當(dāng)PPARγ表達(dá)水平增高時(shí)，可能通過(guò)其作為轉(zhuǎn)錄因子的作用，促進(jìn)PTEN的轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)對(duì)PTEN的調(diào)控影響了細(xì)胞的EMT。

PPARγ的調(diào)節(jié)作是多方面的，PTEN只是其中之一。既往的研究也顯示，PPARγ對(duì)AKT通路和FAK通路存在一定的調(diào)節(jié)作用。但這種調(diào)節(jié)是PPARγ的直接調(diào)節(jié)，還是通過(guò)PTEN來(lái)實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)，目前并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此本研究為了進(jìn)一步明確該問(wèn)題，設(shè)計(jì)了在過(guò)表達(dá)及敲減PTEN的情況下，分別給予PPARγ的抑制劑及激動(dòng)劑的方法，來(lái)進(jìn)一步觀察PPARγ對(duì)下游通路的調(diào)節(jié)是否是通過(guò)PTEN來(lái)實(shí)現(xiàn)的。結(jié)果顯示，與高糖組相比，GW9662組p-AKT（Thr308）、FAK及p-FAK（Tyr397）的蛋白水平增高；GW9662+過(guò)表達(dá)PTEN組與GW9662組相比，p-AKT（Thr308）、FAK及p-FAK（Tyr397）的蛋白水平降低；而給予羅格列酮和敲減PTEN后其趨勢(shì)則相反。這一結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)干預(yù)PTEN的表達(dá)，影響了PPARγ對(duì)AKT及FAK的調(diào)節(jié)效果，也即說(shuō)明PPARγ對(duì)AKT及FAK通路的調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)PTEN實(shí)現(xiàn)的。

本研究初步證實(shí)了PPARγ對(duì)PTEN/AKT/FAK的調(diào)控作用，但涉及該信號(hào)通路的具體調(diào)控過(guò)程及各信號(hào)蛋白之間的相互作用，還需要我們進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和探討。