蔡江怡， 朱樂樂

（1溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院泌尿外科，2溫州市中醫(yī)院病理科，浙江溫州25000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性中常見的惡性腫瘤之一［1］。目前，PCa的治療效果并不令人滿意，PCa遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的5年生存率僅為20%［2］。因此，有必要開發(fā)一種安全有效的PCa治療靶點(diǎn)［3］?？钩聊δ艿鞍?（anti-silencing function 1，ASF1）最初在酵母中被鑒定，屬于組蛋白H3-H4伴侶蛋白［4］。ASF1具有調(diào)節(jié)染色質(zhì)功能，并已被證明有助于腫瘤發(fā)生。ASF1有2個(gè)主要的亞型，分別是ASF1A和ASF1B［5］。研究報(bào)道，ASF1B在人胸腺和睪丸中高表達(dá)［6］。此外，據(jù)報(bào)道ASF1B參與了宮頸癌和乳腺癌的發(fā)展［7］。然而，ASF1B在PCa中的作用仍不清楚。因此，本項(xiàng)工作應(yīng)用細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，探討ASF1B在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)體外細(xì)胞增殖能力的影響。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺增生上皮細(xì)胞系（良性前列腺增生，benign prostatic hyperplasia，BPH）和前列腺癌PC-3細(xì)胞購(gòu)自ATCC。BPH細(xì)胞在含10%胎牛血清（Thermo Fisher Scientifc）、1×105U/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素（Sigma-Aldrich）的DMEM培養(yǎng)液（北京索萊寶科技有限公司）中培養(yǎng)。PC-3細(xì)胞在含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液（北京索萊寶科技有限公司）中培養(yǎng)。將所有細(xì)胞保持在含有5%CO2的37℃加濕培養(yǎng)箱中。

2 方法

2.1 RNA干擾、轉(zhuǎn)染與分組 用經(jīng)過驗(yàn)證的特異性siRNA進(jìn)行ASF1B的敲減，siRNA-ASF1B（購(gòu)自Thermo Fisher Scientific）的正義鏈序列為5'-ACGCAACCCTGTCAGTCTG-3'，反義鏈序列為5'-GGGCAGGTCCACCATTTCC-3'。使用非特異性雜亂siRNA載體作為對(duì)照，其正義鏈序列為5'-AGCAGCTAGAATCCCTGGG-3'，反義鏈序列為5'-AGGCCGAAGGAGTTCCAGT-3'。將PC-3細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板中，分為對(duì)照（control，Con）組、siRNA陰性對(duì)照載體（mock）組和 siRNAASF1B組。對(duì)照組不做任何處理；mock組使用Hieff TransTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Sigma-Aldrich）和siRNA陰性對(duì)照載體（1μg）轉(zhuǎn)染細(xì)胞；siRNA-ASF1B組使用Hieff TransTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和siRNAASF1B（1μg）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃下孵育12 h，隨后收集細(xì)胞并進(jìn)行Western blot、RT-qPCR和MTT實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 通過MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。將上述處理細(xì)胞（1×108/L）接種到96孔培養(yǎng)板中，孵育過夜后，然后向每個(gè)孔中加入10μL MTT溶液（在PBS中2.5 g/L），并將板在37℃下再溫育4 h。離心（2 000×g，10 min）后，吸出含有MTT的培養(yǎng)液，然后加入100μL DMSO。用SynergyHT多功能酶標(biāo)儀（Winooski）在570 nm下測(cè)量每個(gè)孔的吸光度（A）值。

2.3 Western blot分析 收集細(xì)胞在RIPA裂解物緩沖液中裂解，并在冰上進(jìn)行溫和超聲處理。在BCA定量后，向每個(gè)泳道中加入20μg細(xì)胞裂解物，隨后通過8%SDS-PAGE（30 mA，120 min）分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與I抗［兔抗AKT（1∶800稀釋）、兔抗p-AKT（1∶500稀釋）、兔抗pMAP2K4（1∶1 000稀釋）、兔抗p-ERK（1∶1 000稀釋）、兔抗ERK（1∶1 000稀釋）、兔抗JNK（1∶1 000稀釋）、兔抗p-JNK（1∶1 000稀釋）和兔抗β-actin（1∶1 000稀釋），均購(gòu)自Cell Signaling Technology］在4℃溫育過夜，然后與抗生物素蛋白-生物素化的辣根過氧化物酶復(fù)合物II抗在室溫下溫育2 h。使用Image Lab 5.0軟件（Bio-Rad Laboratories）定量靶蛋白和β-actin的條帶強(qiáng)度，并將每種靶蛋白的強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化為相應(yīng)的β-actin水平。

2.4 RT-qPCR分析 使用RNA提取試劑盒（Promega）提取細(xì)胞的總RNA。使用TianScript cDNA Synthesis試劑盒（Tiangen Biotech Co.，Ltd.）將總共1μg的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件如下：85℃5 min，4℃ 5 min。采用SYBR?Premix Ex Taq? II試劑盒（TaKaRa）在ABI 7500 Fast系統(tǒng)（Applied Biosystems）上進(jìn)行qPCR分析。熱循環(huán)設(shè)置如下：在92℃下預(yù)變性5 min；在92℃變性15 s，在58℃退火30 s，在72?C下延伸35 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。β-actin用作加載對(duì)照。通過2-ΔΔCt計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)，并用β-actin進(jìn)行歸一化。用于qPCR擴(kuò)增的引物序列如下：p53的正向引物序列為5'-AAGTAGAGAGGCATCGCAGAGA-3'，反向引物序列為5'-TTCGTTGCTGATTTACTCAGTAGG-3'；Bax的正向引物序列為5'-TCCTTCACCAATGTCAACTCC-3'，反向引物序列為5'-TGATTTTTCAGCCCATCCAC-3'；PARP-1的正向引物序列為5'-CTGTCGCTTCTCAATCAGACTC-3'，反向引物序列為5'-CCCAGGTCATTTCCCATCACTT-3'；caspase-3的正向引物序列為5'-CTGCTCTCCCTAACCCCTTGTC-3'，反向引物序列為5'-CACATAGGTAACGAGTCAGAGC-3'；β-actin的正向引物序列為5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3'，反向引物序列為5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3'。

2.5 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分析 使用膜聯(lián)蛋白VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Sigma-Aldrich）檢查細(xì)胞凋亡。將細(xì)胞接種在6孔板（每孔3×104細(xì)胞）中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后加入5μL膜聯(lián)蛋白VFITC和5 μL PI（50 mg/L）對(duì)細(xì)胞染色，在室溫下避光孵育20 min。進(jìn)行BD FACSAria I/II流式細(xì)胞術(shù)以測(cè)量細(xì)胞凋亡，并使用BD CellQuest Pro 3.3軟件（均來自BD Biosciences）進(jìn)行分析。使用PI染料試劑盒（Sigma-Aldrich）進(jìn)行細(xì)胞周期測(cè)定。PC-3細(xì)胞在通過胰蛋白酶消化收獲并用冷PBS洗滌后，將貼壁細(xì)胞在4%的70%乙醇中固定24 h。隨后，將固定的細(xì)胞洗滌2次并用含有200μL PBS、1μL PI（1 g/L）和1μL RNase（10 g/L）的循環(huán)測(cè)試系統(tǒng)在37℃的黑暗中染色20 min。使用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Student-Newman-Keuls多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ASF1B在PC-3細(xì)胞中的表達(dá)

通過Western blot檢測(cè)ASF1B在BPH和PC-3細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明，正常細(xì)胞（BPH）中ASF1B的蛋白水平顯著低于PC-3細(xì)胞（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.Western blot was used to detect the ASF1B protein expression in BPH and PC-3 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs BPH group.圖1 Western blot分析BPH和PC-3細(xì)胞中ASF1B的蛋白水平

2 siRNA-ASF1B降低PC-3細(xì)胞的活力

通過Western blot檢測(cè)siRNA-ASF1B質(zhì)粒在PC-3細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組和mock組相比，用siRNA-ASF1B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后的ASF1B蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），圖2A。使用MTT法測(cè)定PC-3細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組和mock組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-ASF1B質(zhì)粒的PC-3細(xì)胞的活力顯著降低（P＜0.01），見圖2B。轉(zhuǎn)染12 h后，siRNA-ASF1B顯著降低細(xì)胞活力，因此將siRNAASF1B轉(zhuǎn)染持續(xù)時(shí)間設(shè)定為12 h。

3 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果

與對(duì)照組和mock組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-ASF1B質(zhì)粒的PC-3細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01），且細(xì)胞周期被阻滯于G1期，而G2和S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01），見圖3。

4 siRNA-ASF1B調(diào)節(jié)PC-3細(xì)胞中的凋亡相關(guān)因子

RT-qPCR結(jié)果表明，與對(duì)照組和mock組相比，用siRNA-ASF1B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后，p53、caspase-3、Bax和PARP-1的mRNA水平上調(diào)（P＜0.01），見圖4。

5 siRNA-ASF1B對(duì)PC-3細(xì)胞中MAPK/JNK/ERK信號(hào)通路影響

采用Western blot檢測(cè)MAPK/JNK/ERK信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組和mock組相比，siRNA-ASF1B組PC-3細(xì)胞中MAP2K4和p-JNK蛋白水平顯著升高（P＜0.01），而p-ERK蛋白水平顯著降低（P＜0.01），見圖5。

Figure 2.Western blot was used to detect the ASF1B protein expression in PC-3 cells after treatment for 12 h（A），and the viability of PC-3 cells was determined by MTT assay at 12，24，and 48 h after treatment（B）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.圖2 采用Western blot檢測(cè)各組處理12 h后PC-3細(xì)胞中ASF1B蛋白表達(dá)，并采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞的活力

Figure 3.Flow cytometry was used to analyze the apoptosis（A）and cell cycle distribution（B）of PC-3 cells after treatment for 12 h.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析各組處理12 h后PC-3細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期分布

討 論

目前已證實(shí)ASF1B對(duì)包括乳腺癌細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞系的增殖為關(guān)鍵［7］。ASF1B可能直接上調(diào)與DNA復(fù)制相關(guān)的基因，能夠補(bǔ)償復(fù)制缺陷；ASF1B耗盡的細(xì)胞顯示出形態(tài)改變的細(xì)胞核數(shù)量以及微核和核間DNA橋的數(shù)量顯著增加［6］。這些研究表明ASF1B在有絲分裂過程中可能起作用。本研究顯示，正常細(xì)胞（BPH）中ASF1B的蛋白水平顯著低于PC-3細(xì)胞，這一結(jié)果與乳腺癌和宮頸癌中ASF1B的高表達(dá)相似［7］，提示ASF1B上調(diào)可能有助于PCa的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和分化。

Figure 4.RT-qPCR was used to analyze the mRNA expression of p53，caspase-3，Bax and PARP-1 in PC-3 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.圖4 RT-qPCR分析PC-3細(xì)胞中p53、caspase-3、Bax和PARP-1的mRNA水平

Figure 5.Western blot was used to detect the effect of siRNA-ASF1B on MAPK/JNK/ERK signaling pathway in PC-3 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.圖5 Western blot檢測(cè)siRNA-ASF1B對(duì)PC-3細(xì)胞中MAPK/JNK/ERK信號(hào)通路的影響

抗腫瘤藥物和基因在促進(jìn)腫細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用［8］。先前的一項(xiàng)研究表明，ASF1B的過度表達(dá)顯著增強(qiáng)了乳腺癌的增殖［9］。本研究中，與對(duì)照細(xì)胞相比，siRNA-ASF1B顯著下調(diào)了PC-3細(xì)胞的ASF1B表達(dá)，與此同時(shí)細(xì)胞凋亡率顯著增加。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期分布有關(guān)。凋亡的變化參與細(xì)胞周期階段的調(diào)節(jié)，包括G1、G2和S期［10-12］。類似地，本研究數(shù)據(jù)顯示，siRNA-ASF1B誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞G1期阻滯，表明ASF1B沉默可促進(jìn)PCa的細(xì)胞周期阻滯。為了進(jìn)一步驗(yàn)證siRNA-ASF1B對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，我們檢測(cè)了細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，用siRNA-ASF1B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后p53、caspase-3、Bax和PARP-1的mRNA水平上調(diào)［13-14］。這些結(jié)果表明，ASF1B的敲減通過提高p53、caspase-3、PARP和Bax的表達(dá)水平，加速了PC-3細(xì)胞的凋亡。

MAPK/JNK/ERK信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中起作用，并且已經(jīng)觀察到該通路在各種癌癥類型中失調(diào)［15］。此外，抑制MAPK/JNK信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，并可能增強(qiáng) PCa的凋亡［16］，表明 MAPK/JNK信號(hào)通路在腫瘤進(jìn)展過程中的作用。本研究中，siRNA-ASF1B組中PC-3細(xì)胞的MAP2K4和p-JNK蛋白水平顯著升高（P＜0.01），表明ASF1B的敲減激活了MAPK/JNK途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一方面，已知ERK1/2的激活能有效促進(jìn)細(xì)胞存活［1］。本研究顯示，p-ERK蛋白水平顯著降低。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示，ASF1B的沉默抑制了PCa的存活。因此，激活MAPK/JNK/ERK信號(hào)通路可能是siRNA-ASF1B在PCa中抗腫瘤作用的潛在機(jī)制之一。

總之，本研究結(jié)果表明ASF1B在PC-3細(xì)胞中高度上調(diào)；ASF1B沉默顯著誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞G1期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；激活MAPK/JNK/ERK信號(hào)通路可能是siRNA-ASF1B抗腫瘤作用的機(jī)制之一。