劉 軍 李文靜 柳 茜 劉本臣 董亞楠 張麗媛

寧夏回族自治區(qū)銀川市中醫(yī)醫(yī)院,寧夏 銀川 750001

滴蟲(chóng)性陰道炎是婦科領(lǐng)域常見(jiàn)病，其病情纏綿，不易速愈，且常并發(fā)月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、不孕等疾病。滴陰炎婦科洗液的中藥成分(由苦參、蛇床子、白鮮皮、仙鶴草等)具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)的功效，用于治療白帶增多、外陰瘙癢等癥，療效顯著[1]。筆者前期采用高速離心及無(wú)機(jī)陶瓷膜超濾技術(shù)對(duì)我院使用30余年，組方精當(dāng)?shù)脑簝?nèi)制劑“滴陰炎熏洗液”進(jìn)行工藝改進(jìn)，改善了原制劑澄清度不高的問(wèn)題[1]。氯己定屬于雙胍類(lèi)化合物，有較強(qiáng)廣譜抑菌、殺菌作用且毒性小，性質(zhì)穩(wěn)定，常被作為消毒有效成分廣泛應(yīng)用于消毒產(chǎn)品中，一般用于手、皮膚和黏膜的消毒[2-6]。

本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上將葡萄糖酸氯己定(CHG)與原中藥制劑復(fù)配二次開(kāi)發(fā)為“消準(zhǔn)字號(hào)”產(chǎn)品并建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)大其殺菌范圍，達(dá)到較高效能消毒劑水平，達(dá)到服務(wù)更廣泛人群及產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化目標(biāo)。

1 材料

1.1 儀器 JW-T-1.OB-316陶瓷膜設(shè)備(江蘇久吾高科技股份有限公司，膜材料Al2O3，膜面積0.5m2；離心泵，Q=5.8 m3/h)、XU12WZT-1C 型光電濁度儀(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)，立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，電子天平(METTLER TOLEDO*S205)、磁力攪拌器IKARCT digital(德國(guó)IKA)，DHG-6050 型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)，臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換器(Haier)BC/BD-100HEGW、BPC-150F生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、MJ-1500-II霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、定性濾紙片(5 mm圓形)、無(wú)菌棉拭子、游標(biāo)卡尺、微量移液器(10～100 μL，艾本德上海國(guó)際貿(mào)易有限公司)；

1.2 試藥 試驗(yàn)菌種為大腸埃希菌(CMCC(B)44102，批號(hào)3a28-1)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003，批號(hào)：5a31-2)、白色念珠菌(CMCC(F)98001，批號(hào)2a17-2)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(190328)、沙堡瓊脂培養(yǎng)基(161219)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(190414)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方工藝優(yōu)選

2.1.1 原液除雜工藝優(yōu)選 相比于傳統(tǒng)的醇沉工藝，超濾技術(shù)是精制滴陰炎熏洗液的一種有效方法，超濾技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于有效成分轉(zhuǎn)移率高，生產(chǎn)周期短，省去大量乙醇溶劑。本文前期以蛇床子素、氧化苦參堿的轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，采用1∶8生藥濃度滴陰炎提取液以孔徑為500 nm的Al2O3無(wú)機(jī)陶瓷膜進(jìn)行滴陰炎熏洗超濾液制備[1,4]。

2.1.2 增溶劑優(yōu)選 氯己定難溶于水，多采用溶解度好的胍鹽，如醋酸氯己定、鹽酸氯己定和葡萄糖酸氯己定。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在滴陰炎超濾液中直接加入0.2%CHG后溶液立即變渾濁，故需添加增溶劑來(lái)改善溶解度。聚山梨酯毒性小、無(wú)刺激性，對(duì)許多有機(jī)藥物都有較好的增溶效果，且對(duì)藥物在皮膚和黏膜的吸收具有一定的促進(jìn)作用[7-8]，泊洛沙姆對(duì)皮膚黏膜無(wú)刺激性和過(guò)敏性，能增強(qiáng)難溶性藥物的溶解度，可供肌肉、皮下、靜脈注射應(yīng)用。精密稱(chēng)取20 mL超濾液，分別用吐溫-80、泊洛沙姆108、泊洛沙姆407作為增溶劑，45 ℃、500 r/min攪拌至溶解，加入一定濃度CHG，攪拌均勻靜置。同一濃度下，12 h后觀察溶液物理變化(如顏色變化、澄清度變化)，發(fā)現(xiàn)吐溫80的增溶澄清效果優(yōu)于泊洛沙姆系列，故選擇吐溫80為增溶劑。采用單因素考察，加入1%、2%、3%、4%吐溫-80，以CHG含量為指標(biāo)，按照“2.2.1”測(cè)定，優(yōu)選吐溫-80最佳比例。結(jié)果見(jiàn)討論。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 液相條件：色譜柱: Agilent-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm); 流速: 1.0 mL/min; 柱溫:28 ℃; 進(jìn)樣量: 10 μL；流動(dòng)相: 0.02 moL/L磷酸二氫鉀水溶液(磷酸調(diào)pH至2.5)-乙腈(65∶35); 波長(zhǎng):254 nm。

2.2.2 對(duì)照品母液制備：精密稱(chēng)取醋酸氯己定對(duì)照品適量，加80%乙醇制成1.721 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備：精密量取滴陰炎超濾水液(生藥比1∶8)20 mL，加入吐溫-80、CHG適量，完全溶解后，加入適量保濕劑β-葡聚糖，攪拌均勻后，用乳酸調(diào)至pH值3.7～4.5，定容至25 mL量瓶，待用。

2.2.4 陰性溶液的制備: 精密量取20 mL水溶液代替滴陰炎超濾液，按”2.2.3”項(xiàng)下的方法操作制備得陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：取“2.2.2”對(duì)照品母液0.1、0.25、0.5、0.6、0.8、0.9 mL，用80%乙醇定容至10 mL量瓶，按“2.2.1”液相條件測(cè)定得線性回歸方程Y=23.129X+2.9009，r2=0.9999(線性范圍在17.21～154.8 μg/mL)；

2.2.6 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)：分別取對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件分析。結(jié)果表明：供試品與對(duì)照品在相同的保留時(shí)間有相同色譜峰，且分離度良好為6.03(大于1.5)，其理論塔板數(shù)為8535。陰性無(wú)干擾。結(jié)果如圖1所示。

A.空白溶液 B.陰性對(duì)照品液 C.醋酸氯己定對(duì)照品 D.供試品溶液

2.2.7 樣品制備與測(cè)定 樣品前處理優(yōu)化：精密吸取洗液1 mL，加入0 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL的1 moL/L H2SO4后再用純水定容至25 mL，結(jié)果顯示當(dāng)加入1 moL/L H2SO4≤2 mL時(shí)，隨著加入量的增加，測(cè)得CHG有所增加；當(dāng)加入1 moL/L H2SO4>2 mL之后，CHG的峰面積無(wú)明顯變化；故選在滴陰炎婦科洗液樣品前處理時(shí)先加入2 mL的1 moL/L H2SO4。結(jié)果如圖2所示。

圖2 1 moL/L H2SO4不同加入量對(duì)GHG含量的影響

樣品制備與測(cè)定:精密吸取 1 mL滴陰炎婦科洗液于25 mL 量瓶，加入2.0 mL 的1 moL/L H2SO4溶液，搖勻，加80%乙醇稀釋至刻度，超聲(40HZ)15 min，0.22 μm 濾膜濾過(guò)后，照“2.2.1”項(xiàng)法進(jìn)行液相測(cè)定。計(jì)算公式:C樣=(C對(duì)×A樣/A對(duì))×稀釋定容倍數(shù)×1.43。三樣品中葡萄糖酸氯己定含量為0.199% g/mL。

2.3 抑菌試驗(yàn) 參照《消毒技術(shù)規(guī)范》2002年版中“2.1.8.2”[13]，以抑菌圈的大小為指標(biāo)，采用濾紙片法考察“2.2.”滴陰炎抑菌制劑對(duì)易引起陰道炎的3種致病菌(白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌)的抑菌能力。結(jié)果見(jiàn)圖3及表1。

A.金黃色葡萄球菌 B.大腸埃希菌 C.白色念球菌

表1 滴陰炎婦科洗液對(duì)3種致病菌的對(duì)應(yīng)抑菌結(jié)果

3 討論

3.1 增溶劑的選擇 葡萄糖酸氯己定為陽(yáng)離子表面活性劑，在皮膚的消毒上具有持續(xù)抗菌活性[5]。堿性物質(zhì)如肥皂、陰離子表面活性劑、某些銀離子藥物能降低其殺菌效果[6]。吐溫-80 是帶有雙官能團(tuán)陰-非離子復(fù)合型表面活性劑，具有陰離子和非離子型表面活性劑的雙重特點(diǎn)，在水中有良好的溶解性，同時(shí)有較好的起泡能力，抗硬水、無(wú)機(jī)鹽能力，且對(duì)人體無(wú)刺激性反應(yīng)，對(duì)CHG有良好的促溶作用，是較理想的增溶劑[8]。本研究以CHG含量及溶液澄清度為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)吐溫-80、泊洛沙姆407加入量(1%、2%、3%、4%)進(jìn)行考察，結(jié)果顯示：吐溫-80不同比例對(duì)應(yīng)的CHG峰面積分別為(865.9、944.2、1277.8、1527.8)，表明加入吐溫-80的滴陰炎婦科洗液中2%～3%之間溶解度明顯增加，而3%～4%溶解度增加不明顯。而泊洛沙姆407不同比例對(duì)應(yīng)的CHG峰面積分別為(1326.8、1310.2、1350.7、1387.0)，12 h后觀察溶液物理變化(如顏色變化、澄清度變化)，發(fā)現(xiàn)吐溫80的增溶澄清效果優(yōu)于泊洛沙姆系列。綜合考慮澄清度和性狀，選擇加入3%吐溫80。

3.2 CHG含量測(cè)定及抑菌試驗(yàn) 本研究對(duì)比了紫外分光光度測(cè)定與高效液相測(cè)定方法，結(jié)果表明紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果偏高，且可能由于中藥成分在同一波長(zhǎng)對(duì)其有吸收，測(cè)定不穩(wěn)定且偏高。而HPLC測(cè)定靈敏度及專(zhuān)屬性高，較為穩(wěn)定，更適合滴陰炎婦科洗液的含量測(cè)定，故選用HPLC測(cè)定方法對(duì)CHG進(jìn)行跟蹤并作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一。抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)顯示滴陰炎婦科洗液對(duì)3種致病菌均有抑菌作用，但對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌抑菌效果優(yōu)于白色念珠菌。

滴陰炎婦科洗液適用于婦科疾病預(yù)防及治療，本研究創(chuàng)新性地將傳統(tǒng)滴陰炎熏洗液經(jīng)超濾處理后二次開(kāi)發(fā)婦科洗液，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用和開(kāi)發(fā)價(jià)值。后期將進(jìn)一步對(duì)該洗液進(jìn)行陰道黏膜刺激等研究，以期將其開(kāi)發(fā)為消毒產(chǎn)品，擴(kuò)大其使用范圍。