武運(yùn)邦 謝 紅 王金義 肖開(kāi)蘋(píng) 潘欣陽(yáng) 楊邯捷 趙惠亮 渠景連

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025

肺纖維化(Pulmonary Fibrosis，PF)是一種多病因且發(fā)病機(jī)制不明確的肺部疾病，其主要病理變化是初期的彌漫性肺泡炎和后期的成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積[1]。其中，肺泡上皮細(xì)胞的易損性、異常重塑、表型改變是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal Transition，EMT)是上皮細(xì)胞向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程，在這一過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)逐漸丟失，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)升高[3]。研究表明，EMT與肺纖維化密切相關(guān)，它被證明是肌成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源，而肌成纖維細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與組織纖維化[4]。在EMT過(guò)程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號(hào)通路被激活，Smad3作為T(mén)GF-β信號(hào)通路中一個(gè)重要的組成部分，對(duì)于TGF-β1介導(dǎo)的EMT極其重要[5]。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為肺纖維化的病變實(shí)質(zhì)是“肺絡(luò)瘀滯”，故活血化瘀通絡(luò)是該病的主要治法。血府逐瘀湯出自于清代醫(yī)家王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，是活血化瘀的代表方劑。臨床研究表明，血府逐瘀湯對(duì)肺纖維化的抑制與改善作用明顯[6-7]，關(guān)于該方藥理作用的研究也逐漸增多，但尚未見(jiàn)從EMT角度進(jìn)行研究的報(bào)道。本研究以EMT為切入點(diǎn)，探討血府逐瘀湯對(duì)PF模型大鼠肺組織EMT的影響，并從TGF-β1/Smad3出發(fā)進(jìn)一步分析其可能機(jī)制，以期為闡明該方防治PF的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥物與試劑 血府逐瘀湯由桃仁、川芎、桔梗、赤芍、枳殼、甘草、柴胡、紅花、當(dāng)歸、生地黃、牛膝組成，藥物購(gòu)自貴陽(yáng)同仁堂藥房。其中：桃仁(批號(hào)：170401，產(chǎn)地：山東)；川芎(批號(hào)：170701，產(chǎn)地：安徽)；桔梗(批號(hào)：170301，產(chǎn)地：安徽)；赤芍(批號(hào)：170401，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古)；枳殼(批號(hào)：170401，產(chǎn)地：江西)；甘草(批號(hào)：180301，產(chǎn)地：新疆)；柴胡(批號(hào)：170301，產(chǎn)地：山西)；紅花(批號(hào):171201，產(chǎn)地：新疆)；當(dāng)歸(批號(hào)：170701，產(chǎn)地：甘肅)；生地黃(批號(hào)：171201，產(chǎn)地：河南)；牛膝(批號(hào)：170401，產(chǎn)地：河南)。分別煎制濃縮為含生藥0.351、0.702、1.404 g·mL-1的合劑，每次制備3 d藥量，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

醋酸地塞米松片(批號(hào)：151238，浙江仙琚制藥股份有限公司)；博來(lái)霉素(批號(hào)：16032311，海正輝瑞制藥有限公司)；α-SMA抗體(一抗，兔源，批號(hào)：AG02247616，北京博奧森生物技術(shù)公司)；Smad3抗體(一抗，兔源，批號(hào)：GR3190902-12，英國(guó)abcam公司)；TGF-β1抗體(一抗，兔源，批號(hào)：55e6713，Affinity公司)；E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體(一抗，兔源，批號(hào)：18k0657，Affinity公司)；β-actin抗體(一抗，小鼠源，批號(hào)：48k2671)、山羊抗兔辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗(批號(hào)：3825j63)、山羊抗小鼠辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗(批號(hào)：1292k61)均購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司；Mayer蘇木素染液(批號(hào)：20170526)、DAB顯色試劑盒(批號(hào)：20170511)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：SE248353，美國(guó)Thermo Scientific公司)；ECL發(fā)光液(批號(hào)：1716501)、PVDF膜(批號(hào)：MB0323)均購(gòu)自默克密理博有限公司。

1.3 主要儀器 Allegra X-30R離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司)；GNP-9080隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司)；1150H石蠟包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司)；RM2265輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；PL303電子天平(梅特勒-托利多儀器公司)；BX 53顯微圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)；PowerPacTMBasic電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)等。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制備 將大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、地塞米松組、血府逐瘀湯高、中、低劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組均采用氣管滴注博來(lái)霉素復(fù)制PF模型[8]：用10%水合氯醛 3 mL·kg-1麻醉大鼠后，頸部皮膚消毒，剪去頸部鼠毛，行頸正中切口，分離暴露氣管。經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端穿刺注入博來(lái)霉素5 mg/kg，在注射過(guò)程中必須非常緩慢的注入，并且邊注射邊觀察大鼠胸廓的起伏，防止堵塞氣道，導(dǎo)致大鼠的死亡。注射完成后立即將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻，然后縫合皮膚。正常組動(dòng)物在同樣條件下注入等量生理鹽水。術(shù)后讓大鼠自由飲水、進(jìn)食。

2.2 給藥 造模后第2 d開(kāi)始每天灌胃給藥，正常組和模型組予蒸餾水溶液(10 mL·kg-1·d-1)；地塞米松組予等容積地塞米松蒸餾水溶液(0.000405 g·kg-1·d-1)；血府逐瘀湯高劑量組(14.04 g·kg-1·d-1)、血府逐瘀湯中劑量組(7.02 g·kg-1·d-1)和血府逐瘀湯低劑量組(3.51 g·kg-1·d-1)分別給予等容積藥液。每日灌胃1次，連續(xù)給藥28 d。

2.3 標(biāo)本采集 治療后第28 d，以10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉大鼠，股動(dòng)脈放血后剖取兩肺，剪除氣管、支氣管，將左肺組織用冰鹽水沖洗3遍，濾紙吸干水分，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟，用免疫組化法檢測(cè)肺組織上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadherin)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(α-SMA)的表達(dá)水平。右肺分裝于1.5 mL EP管，轉(zhuǎn)存-80 ℃冰箱凍存，用蛋白免疫印跡法(Western blot)觀察各組肺組織中TGF-β1 和Smad3的蛋白表達(dá)變化。

2.4 免疫組化法檢測(cè)肺組織中E-cadherin和α-SMA的表達(dá) 將石蠟切片放于60 ℃烤箱中2 h；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各2 min脫蠟至水；3%H2O2室溫滅活10～15 min；PBS沖洗3次/5分鐘；抗原熱修復(fù)10 min，冷卻至室溫；PBS沖洗3次/5分鐘；滴加封閉液5% BSA，滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜；PBS沖洗3次/5 min；滴加二抗，濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次/5 min；DAB顯色，蘇木素核復(fù)染，梯度乙醇逐步脫水，二甲苯進(jìn)行透明，最后用中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值，以此反映相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)肺組織中TGF-β1和Smad3的表達(dá) 取大鼠右肺上葉肺組織100 mg，加入1 mL預(yù)冷的裂解液，用電動(dòng)勻漿器在冰上勻漿，于4 ℃下以12000 r·min-1離心20 min，收集上清液；取少量上清液進(jìn)行蛋白定量；剩下的加入等體積2×上樣緩沖液，95℃水浴煮5 min后于-80 ℃冰箱保存，備測(cè)。取上述蛋白適量進(jìn)行SDS-PAGE電泳(電壓100 V，時(shí)間1.5 h)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，于5%脫脂奶粉中封閉1 h；分別加入一抗溶液(TGF-β1、Smad3兔單克隆抗體，稀釋度為1∶5000)孵育，4℃ 孵育過(guò)夜；取出PVDF膜，TBST洗3次；加入二抗常溫孵育1 h，取出PVDF膜，TBST洗3次，經(jīng)ECL顯色后于凝膠成像系統(tǒng)中顯影；采用ImageJ 1.51K軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 血府逐瘀湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織E-cadherin、α-SMA表達(dá)的影響 模型組大鼠肺組織E-cadherin表達(dá)顯著低于正常組(P<0.01)，而α-SMA表達(dá)顯著高于正常組(P<0.01)。與模型組比較，血府逐瘀湯高、中、低劑量組肺組織E-cadherin表達(dá)均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而α-SMA表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與地塞米松組比較，血府逐瘀湯低劑量組的E-cadherin表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而α-SMA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1和圖2。

表1 血府逐瘀湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織E-cadherin、α-SMA表達(dá)的影響

A.正常組；B.模型組；C.血府逐瘀湯高劑量組；D.血府逐瘀湯中劑量組；E.血府逐瘀湯低劑量組；F.地塞米松組

A.正常組；B.模型組；C.血府逐瘀湯高劑量組；D.血府逐瘀湯中劑量組；E.血府逐瘀湯低劑量組；F.地塞米松組

3.2 血府逐瘀湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1、Smad3表達(dá)的影響 模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3的表達(dá)顯著高于正常組(P<0.01)。與模型組比較，血府逐瘀湯高、中、低劑量組肺組織TGF-β1、Smad3表達(dá)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與地塞米松組比較，血府逐瘀湯低劑量組的TGF-β1、Smad3表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 血府逐瘀湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1、Smad3表達(dá)的影響

A.正常組；B.模型組；C.血府逐瘀湯高劑量組；D.血府逐瘀湯中劑量組；E.血府逐瘀湯低劑量組；F.地塞米松組

4 討論

PF是肺組織受損后人體自身修復(fù)的結(jié)果，也是以成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的多種肺部疾病的最終結(jié)局。臨床主要表現(xiàn)為干咳、進(jìn)行性呼吸困難，且隨著病情加重，呼吸功能不斷惡化，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。如前所述，EMT是上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，其在PF和肌成纖維細(xì)胞活化的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。EMT發(fā)生時(shí)，上皮細(xì)胞極性消失，上皮細(xì)胞標(biāo)志物下調(diào)，細(xì)胞骨架重排，遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物上調(diào)[3]。

研究表明，多種細(xì)胞因子參與了EMT過(guò)程，尤其是TGF-β1，是目前公認(rèn)的促進(jìn)EMT的核心細(xì)胞因子[9]，在此過(guò)程中，TGF-β1促進(jìn)了上皮細(xì)胞表型的丟失。TGF-β1介導(dǎo)EMT的途徑眾多，但主要依賴Smad途徑[10]。Smad蛋白家族是一類細(xì)胞內(nèi)TGF-β受體激酶的底物[11]，其本身既是轉(zhuǎn)錄因子，也是其他轉(zhuǎn)錄因子如Slug、Snail、Scatter、淋巴增強(qiáng)因子1、β連環(huán)蛋白等的誘導(dǎo)物[12]。Smad3控制一系列Smad依賴的靶基因轉(zhuǎn)錄[13]，TGF-β1受體絲氨酸-蘇氨酸激酶激活Smad2/3后，使其磷酸化，Smad3與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)入到細(xì)胞核，從而與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致EMT及PF的發(fā)生。Wang等[14]在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白27和Smad3表達(dá)均增加，進(jìn)而激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路促進(jìn)EMT。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PF的病變實(shí)質(zhì)是“肺絡(luò)瘀滯”。肺為嬌臟，外易受六淫之邪，內(nèi)可生瘀血為患，諸因素均可閉阻氣機(jī)，導(dǎo)致肺絡(luò)之氣血運(yùn)行受阻，氣血不暢，更易釀生瘀血，從而造成肺絡(luò)瘀滯而發(fā)病[15]。李菊蓮等[16]也認(rèn)為本病早期毛細(xì)血管增生、擴(kuò)張、充血，管壁增厚，晚期由于大量纖維結(jié)締組織增殖而收縮，毛細(xì)血管數(shù)量減少甚至閉鎖，說(shuō)明PF存在肺絡(luò)瘀滯病機(jī)。“絡(luò)以通為用”，因此，治療本病當(dāng)以活血通絡(luò)為主。血府逐瘀湯是王清任所創(chuàng)的活血化瘀五大名方之一，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡，枳殼、甘草組成。諸藥合用，不僅可行血分之瘀滯，又可解氣分之郁結(jié)，寓行氣于活血之中，寓養(yǎng)于行散之中，活血而不耗血，袪瘀又能生新，升降同用，使瘀血下行，氣機(jī)暢達(dá)，臟腑和調(diào)?，F(xiàn)代藥理研究表明，血府逐瘀湯可通過(guò)抑制Smad3、MMP-7的蛋白表達(dá)來(lái)降低肺纖維化程度[17]，此外對(duì)氧自由基損傷也有不同程度的干預(yù)作用，并可通過(guò)降低血清HA、肺組織HYP、膠原蛋白含量及提高彈性纖維含量來(lái)改善其細(xì)胞外基質(zhì)代謝[18]。在此基礎(chǔ)上，本研究以療效較好的地塞米松為陽(yáng)性對(duì)照，探討了血府逐瘀湯對(duì)PF模型大鼠肺組織中上皮細(xì)胞標(biāo)志物、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)以及TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織E-cadherin表達(dá)較正常組顯著降低，而α-SMA表達(dá)較正常組顯著升高，提示模型復(fù)制成功。給予不同劑量的血府逐瘀湯后，各給藥組大鼠E-cadherin表達(dá)顯著升高，而α-SMA表達(dá)顯著降低，表明該方可不同程度地上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)α-SMA表達(dá)，提示該方防治PF的作用可能與抑制EMT有關(guān)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的表達(dá)顯著升高，提示PF發(fā)生后TGF-β1/Smad3信號(hào)通路被激活，給予不同劑量的血府逐瘀湯后，大鼠肺組織TGF-β1、Smad3表達(dá)均顯著降低，提示血府逐瘀湯治療PF的機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有關(guān)。此外，本研究結(jié)果還顯示，血府逐瘀湯低劑量組大鼠肺組織E-cadherin表達(dá)顯著低于地塞米松組，α-SMA、TGF-β1、Smad3表達(dá)顯著高于地塞米松組，而中、高劑量組與地塞米松組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示中劑量組(7.02 g·kg-1·d-1)、高劑量組(14.04 g·kg-1·d-1)血府逐瘀湯對(duì)PF模型的改善作用與地塞米松相當(dāng)。

綜上所述，血府逐瘀湯可通過(guò)干預(yù)EMT來(lái)減輕模型大鼠的肺纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有關(guān)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。