王艷君，李宏坤，孫明新，李艷紅，薛維華

(1.河北中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 石家莊 050011；2.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

原發(fā)性高血壓是以血壓升高為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，是心腦血管疾病的重要病因和危險(xiǎn)因素[1]，中國的原發(fā)性高血壓患病率高達(dá)18.8%[2]。原發(fā)性高血壓作為世界上流行最廣、危害最重且隱蔽最深的一種心血管疾病，一直倍受關(guān)注[3]。目前原發(fā)性高血壓的診斷不僅僅局限于血壓水平，血壓晝夜節(jié)律模式已列為原發(fā)性高血壓診斷和評(píng)估心血管事件發(fā)生率的參考標(biāo)準(zhǔn)之一[4]。針刺治療原發(fā)性高血壓的研究越來越受到重視，一般認(rèn)為其治療機(jī)制與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，抑制炎癥因子和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血管內(nèi)皮功能等有關(guān)[5]。近些年采用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究疾病機(jī)制已成為研究的新方向。血壓的晝夜節(jié)律主要受控于生物鐘[6]，其中鐘基因Clock、Bmal1是關(guān)鍵的信號(hào)分子，人體多數(shù)外周組織如心臟、腎臟都存在生物鐘系統(tǒng)。筆者的前期研究[7]提示，針刺可以降低自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)“雙峰”血壓，其降壓效應(yīng)可能與調(diào)節(jié)血清5羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、褪黑素(melatonin，MT)水平有關(guān)。故本次研究主要從鐘基因Clock、Bmal1調(diào)控出發(fā)，進(jìn)一步探討針刺調(diào)節(jié)血壓的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 11周齡SPF級(jí)健康雄性SHR大鼠24只，體質(zhì)量為(260.00±9.04)g，同周齡健康雄性Wister-Kyoto(WKY)大鼠12只，體質(zhì)量為(255.30±5.66)g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。在普通動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度為(21±2)℃，濕度為45%～55%，自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑與儀器 大鼠MT試劑盒(批號(hào) E02M0005)、5-HT試劑盒(批號(hào) E02H0106)：上海藍(lán)基生物科技有限公司；DEPC(批號(hào) 20160802554)：Sigma公司；RNAiso Plus(批號(hào) 9108)、RT試劑(批號(hào) RR047Q)：TaKaRa公司；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(批號(hào) FP209)：Tiangen公司；一次性使用針灸針(0.25 mm×25 mm)：長春愛康醫(yī)療器械有限公司；全自動(dòng)大小鼠無創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(BP-100A)：成都泰盟軟件有限公司；電針儀(BT701-1B型)：上海華誼醫(yī)用器械有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(規(guī)格7500fast)：ABI公司。

2 方法

2.1 分組 將24只SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為針刺組和模型組，每組12只，12只WKY大鼠為正常組。

2.2 干預(yù)方法 針刺組于辰時(shí)針刺SHR雙側(cè)曲池、足三里，取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]，將大鼠裝入自制固定器內(nèi)，常規(guī)無菌操作后毫針直刺穴位，接通電針儀，干預(yù)4周。模型組和正常組在正常條件下飼養(yǎng)4周，每日僅接受與針刺組同等強(qiáng)度捆綁操作。

2.3 觀察指標(biāo)及檢驗(yàn)方法

2.3.1 各組大鼠SBP和DBP比較 采用尾套法測(cè)量血壓。采用全自動(dòng)無創(chuàng)血壓測(cè)量儀，按照操作規(guī)程進(jìn)行測(cè)量，血壓測(cè)定均由同一人操作。各組大鼠分別于治療前和治療結(jié)束后次日，在辰、酉兩個(gè)時(shí)辰隨機(jī)抽取6只測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，每只大鼠連續(xù)測(cè)量5次，取平均血壓值。

2.3.2 各組血清MT、5-HT水平比較 治療結(jié)束后，將各組大鼠隨機(jī)分為辰時(shí)和酉時(shí)2個(gè)組，每組6只，在相應(yīng)時(shí)辰進(jìn)行心臟采血與樣本采集。動(dòng)物麻醉灌流后，快速斷頭處死大鼠，開胸暴露心臟采血，3 500 r/min離心15 min，取血清樣品，-80 ℃保存。采用ELISA法測(cè)定血清MT、5-HT水平。取出心臟置于冰盒上，剪取左心室肌，生理鹽水沖洗后置于無RNA酶的EP管中經(jīng)液氮固定，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 各組大鼠心臟基因Clock和Bmal1相對(duì)表達(dá)水平比較 采用RT-PCR檢測(cè)心臟Clock、Bmal1基因的表達(dá)。取組織約100 mg，應(yīng)用RNAiso Plus試劑提取組織中RNA，反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測(cè)鐘基因Clock、Bmal1 mRNA的表達(dá)。得到各樣本各目的基因及內(nèi)參基因GAPDH的CT值，ΔCT=目的基因CT值-內(nèi)參基因GAPDH的CT值，按照公式Q= 2-ΔΔCT，得到每個(gè)目的基因的Q值及Q均值，再以每個(gè)目的基因的Q值/Q均值，即各目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)。操作步驟均參照試劑盒說明書。大鼠內(nèi)參基因GAPDH及目的基因的引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 干預(yù)前各組大鼠SBP和DBP比較 干預(yù)前針刺組和模型組SBP和DBP均高于正常組(P<0.05)；針刺組和模型組SBP和DBP比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表2。

表2 干預(yù)前各組大鼠SBP和DBP比較

3.2 不同時(shí)辰針刺對(duì)各組大鼠SBP和DBP的影響 模型組辰、酉兩個(gè)時(shí)辰的SBP和DBP均高于正常組(P<0.05)，針刺組辰時(shí)SBP和DBP以及酉時(shí)SBP均低于模型組(P<0.05)。兩因素方差分析結(jié)果顯示，分組因素對(duì)SBP、DBP的主效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，時(shí)辰因素對(duì)SBP、DBP的主效應(yīng)及兩者的交互作用均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、表4。

表3 不同時(shí)辰針刺對(duì)各組大鼠SBP和DBP的影響

表4 時(shí)辰因素和分組因素對(duì)大鼠血壓影響的兩因素方差分析結(jié)果

3.3 不同時(shí)辰針刺對(duì)各組大鼠血清MT和5-HT含量的影響 模型組辰時(shí)MT含量低于正常組，5-HT含量高于正常組(P<0.05)，針刺組辰、酉兩個(gè)時(shí)辰的MT含量均高于模型組，辰時(shí)5-HT含量低于模型組(P<0.05)。兩因素方差分析結(jié)果顯示，分組因素對(duì)MT的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，分組因素對(duì)5-HT含量的主效應(yīng)、時(shí)辰因素對(duì)MT和5-HT含量的主效應(yīng)及兩者的交互作用均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5、表6。

表5 不同時(shí)辰針刺對(duì)各組大鼠MT和5-HT含量的影響

表6 時(shí)辰因素和分組因素對(duì)大鼠MT和5-HT含量影響的兩因素方差分析結(jié)果

3.4 不同時(shí)辰針刺對(duì)各組大鼠心臟基因Clock和Bmal1相對(duì)表達(dá)水平的影響 針刺組辰時(shí)心臟Clock基因、酉時(shí)心臟Bmal1基因的相對(duì)表達(dá)水平均高于模型組(P<0.05)。兩因素方差分析結(jié)果顯示，分組因素對(duì)Clock和Bmal1相對(duì)表達(dá)水平的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，時(shí)辰因素對(duì)Clock和Bmal1相對(duì)表達(dá)水平的主效應(yīng)及兩者的交互作用均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7、表8。

表7 不同時(shí)辰針刺對(duì)各組大鼠Clock和Bmal1相對(duì)表達(dá)水平的影響

表8 時(shí)辰因素和分組因素對(duì)大鼠心臟基因Clock和Bmal1相對(duì)表達(dá)水平影響的兩因素方差分析結(jié)果

4 討論

原發(fā)性高血壓是一種常見的慢性病，據(jù)調(diào)查，2010年因高血壓死亡的人數(shù)占中國心血管病死亡總?cè)藬?shù)的24.60%，且呈逐年增長的態(tài)勢(shì)[9]。正常情況下，人夜間血壓均值應(yīng)略低于白天，24 h血壓呈現(xiàn)“雙峰一谷”的“長柄杓”曲線，有益于適應(yīng)機(jī)體活動(dòng)、保護(hù)靶器官結(jié)構(gòu)和功能。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快和社會(huì)壓力的增大，血壓晝夜節(jié)律紊亂的人數(shù)在全世界范圍內(nèi)正日益增長。盡管高血壓和血壓晝夜節(jié)律紊亂可以通過不同的藥物治療，但是藥物的不良反應(yīng)仍然是一個(gè)不容忽視的問題。而且某些藥物，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、β受體阻滯劑在降壓的同時(shí)又增大了血壓變異性[10]。針灸作為一種安全有效的治療方法，對(duì)治療原發(fā)性高血壓有一定的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)能有效調(diào)整紊亂的高血壓晝夜節(jié)律。雷云等[11]發(fā)現(xiàn)針刺療法配合常規(guī)西藥治療能夠有效改善原發(fā)性高血壓患者血壓晝夜節(jié)律及相關(guān)動(dòng)態(tài)血壓參數(shù)。李洪波等[12]通過時(shí)辰取穴針刺，證明針刺對(duì)“非杓型”高血壓病患者有明顯的調(diào)節(jié)作用。

生物節(jié)律是生物固有的內(nèi)源性特征，人體許多生理功能如血壓、睡眠均呈現(xiàn)節(jié)律變化，這些節(jié)律受體內(nèi)生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控。生物鐘是一種自持振蕩機(jī)制，由輸入部分、時(shí)鐘系統(tǒng)、輸出部分三部分組成[13]。輸入部分由授時(shí)因子構(gòu)成，主要分為光性授時(shí)因子和非光性授時(shí)因子[14]。時(shí)鐘系統(tǒng)包括中樞生物鐘與外周生物鐘系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物的中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核，而外周生物鐘存在于心、肺、腎等外周器官組織中。輸出部分包括神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)兩大途徑[15]。傳入通路將感受到的外界變化信息傳遞給中央振蕩器，在后者整合以后，經(jīng)傳出通路輸送給靶器官，使之表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性[16]。晝夜節(jié)律發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)是分子計(jì)時(shí)器，即晝夜節(jié)律生物鐘。它是由一組特異的核心元件(包括Clock、Bmal1、Per、Cry 4個(gè)生物鐘基因)組成的正負(fù)調(diào)節(jié)回路。其中Clock基因和Bmal1基因構(gòu)成自主調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄和翻譯反饋環(huán)路，對(duì)于維持晝夜節(jié)律振蕩環(huán)有重要意義[17]。近年來大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，MT具有調(diào)節(jié)生物鐘，穩(wěn)定并且重建體內(nèi)生物節(jié)律的作用[18]，作為一種非光性授時(shí)因子，以第一信使的形式對(duì)許多生理功能的晝夜節(jié)律起調(diào)節(jié)作用[19]。MT的減少或晝夜節(jié)律紊亂，可能是導(dǎo)致高血壓發(fā)生的原因之一[20]。通過升高內(nèi)源性MT或給予外源性MT，能在降壓的基礎(chǔ)上恢復(fù)血壓晝夜節(jié)律，對(duì)穩(wěn)定血壓節(jié)律具有重要意義[21]。5-HT是一種組蛋白修飾劑，可能影響基因表達(dá)[22]。同時(shí)，5-HT能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的收縮、增生，參與血壓的調(diào)節(jié)[23]。血壓是評(píng)估心血管功能最直接、有效的生理參數(shù)[24]。在大多數(shù)心血管疾病的病理過程中，存在有生物節(jié)律基因和相應(yīng)的時(shí)鐘基因的異常表達(dá)[25]。心臟是心血管系統(tǒng)中最為關(guān)鍵的器官，其生物鐘系統(tǒng)受中樞生物鐘系統(tǒng)通過體液因子、激素和神經(jīng)信號(hào)的調(diào)控，產(chǎn)生與中樞生物鐘系統(tǒng)相同步的晝夜節(jié)律[26]。

中醫(yī)時(shí)間醫(yī)學(xué)以整體觀為理論基礎(chǔ)，根據(jù)人體生命活動(dòng)周期及變化規(guī)律指導(dǎo)養(yǎng)生和疾病的防治[27]。子午流注學(xué)說屬于中醫(yī)時(shí)間醫(yī)學(xué)的一部分，是指十二經(jīng)脈隨著十二時(shí)辰的更替，其氣血流注也發(fā)生相應(yīng)的節(jié)律性變化。孟建曉等[28]總結(jié)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)子午流注時(shí)辰規(guī)律治療高血壓患者，可有效調(diào)節(jié)患者氣血陰陽，改善紊亂的血壓晝夜節(jié)律，保護(hù)靶器官。本次實(shí)驗(yàn)選擇辰時(shí)針刺，辰時(shí)屬足陽明胃經(jīng)，是陽明經(jīng)氣血最盛之時(shí)，同時(shí)也是高血壓患者氣血紊亂之時(shí)。取手足陽明經(jīng)的合穴曲池、足三里，兩陽相配，兩合相會(huì)，共調(diào)全身氣血陰陽。沈攀攀等[29]通過研究也證實(shí)，同名經(jīng)配穴效應(yīng)存在，降壓效果明顯。故本次實(shí)驗(yàn)選擇辰時(shí)針刺足三里、曲池，以內(nèi)斂陽氣，納陰蓄血。同時(shí)根據(jù)血壓的兩個(gè)峰值，選擇辰時(shí)和酉時(shí)觀察各項(xiàng)指標(biāo)變化，探究針刺治療原發(fā)性高血壓的時(shí)效規(guī)律以及降壓的作用機(jī)制。

兩因素方差分析結(jié)果顯示，分組因素對(duì)SBP、DBP、血清MT含量、Clock表達(dá)結(jié)果的RQ值、Bmal1表達(dá)結(jié)果的RQ值的主效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，時(shí)辰因素對(duì)各指標(biāo)的主效應(yīng)和兩者的交互作用均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明本實(shí)驗(yàn)中分組是影響結(jié)果的主要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，SHR的血壓和血清MT、5-HT及心臟Clock和Bmal1的表達(dá)變化具有一定的規(guī)律性，辰時(shí)針刺組的SBP和DBP均低于模型組，說明此時(shí)針刺具有降壓效應(yīng)；針刺組MT含量較模型組升高(P<0.05)，5-HT含量較模型組降低(P<0.05)，心臟基因Clock表達(dá)結(jié)果較模型組顯著升高(P<0.05)。此結(jié)果提示，針刺可能是通過提高SHR心臟Clock基因的表達(dá)，提升血清MT含量，降低5-HT含量，從而實(shí)現(xiàn)降壓效果。酉時(shí)針刺組SBP均低于模型組(P<0.05)，說明此時(shí)針刺具有降低收縮壓的作用；針刺組MT含量較模型組升高(P<0.05)，心臟Bmal1基因表達(dá)水平較正常組和模型組顯著升高(P<0.05)。此結(jié)果提示，針刺可能是通過提高SHR心臟Bmal1基因的表達(dá)水平，提升血清MT含量，從而實(shí)現(xiàn)降低收縮壓的效果，推測(cè)提高M(jìn)T含量和心臟Bmal1基因的表達(dá)水平只是針刺多靶點(diǎn)降壓機(jī)制的一部分。研究[30]發(fā)現(xiàn)，電針作為一種外源性授時(shí)因子，可以促進(jìn)節(jié)律紊亂的恢復(fù)。針刺可能是在辰時(shí)和酉時(shí)通過提升血清MT含量、減少5-HT含量，以及提高心臟Clock和Bmal1基因的表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)辰、酉時(shí)“雙峰”血壓的調(diào)節(jié)。但本次實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了外周心臟鐘基因表達(dá)水平的檢測(cè)，未進(jìn)行中樞組織基因的觀察分析。今后應(yīng)增加對(duì)下丘腦視交叉上核內(nèi)生物鐘基因表達(dá)的檢測(cè)，探索中樞-外周生物鐘協(xié)同作用機(jī)制，同時(shí)增加不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，對(duì)針刺降壓的機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。