張永晨，秦合偉，趙平麗

(1.駐馬店市中醫(yī)院，河南 駐馬店 463000，2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成與脂質(zhì)代謝紊亂、血液流變學(xué)異常和炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥因子的釋放，導(dǎo)致血管局部產(chǎn)生一種過度的慢性炎性增生反應(yīng)，miRNA-467b可能參與了脂質(zhì)代謝與炎癥因子的調(diào)控[2-3]。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，miR-467b能夠通過靶向調(diào)控血管壁細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞中脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成、炎癥因子表達(dá)及黏附分子上調(diào)。既往研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，血管軟化丸能夠通過調(diào)節(jié)血脂、抗感染、保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制血小板聚集和調(diào)節(jié)免疫等作用，發(fā)揮抗AS的作用。因此，本實驗擬在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討血管軟化丸通過調(diào)控miRNA-467b及其下游信號通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂、抗感染的作用以實現(xiàn)抗AS。

1 材料

1.1 實驗動物與細(xì)胞 60只ApoE-/-小鼠，購自南京大學(xué)模式動物研究所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。12只C57BL/6J小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2004-0011。所有小鼠均為雄性SPF級，8周齡，體質(zhì)量為(18±2)g，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗中心(國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研實驗室，序號TCM-2009-243)。SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量為(300±20)g，購自南京大學(xué)模式動物研究所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。RAW264.7巨噬細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；本研究所涉及的動物及相關(guān)材料均通過本單位倫理委員會審查和批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 實驗所用血管軟化丸組成：山楂、神曲、珍珠、代赭石各30 g，萊菔子、茯苓、枸杞各15 g，陳皮、連翹、郁金、三七、丹參各12 g，清半夏9 g。中藥均來源于河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，由醫(yī)院煎藥房煎煮和濃縮成不同濃度的湯劑(血管軟化丸高劑量：濃度為3.456 g/mL；血管軟化丸低劑量：濃度為0.864 g/mL)[7]。

2 方法

2.1 中藥含藥血清的制備 將30只雄性健康SD大鼠隨機分為血管軟化丸高劑量組、低劑量組和空白對照組，每組10只。中藥高劑量組每日灌胃給予血管軟化丸86.4 g/kg；中藥低劑量組每日灌胃給予血管軟化丸21.6 g/kg；每日早晚2次，連續(xù)5 d。對照組給予等容量生理鹽水。末次給藥后1 h，采用0.3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，37 ℃靜置，離心，分離血清，微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

2.2 體外實驗

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基中，呈單層生長，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)、傳代，傳代時用0.25%胰蛋白酶消化，加適量培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，實驗用對數(shù)生長期細(xì)胞，待培養(yǎng)瓶中RAW264.7細(xì)胞的密度達(dá)到80%，HBSS洗液洗滌2次，去除培養(yǎng)基；胰酶消化，達(dá)到形態(tài)好(指小、圓形)的消化效果后彎嘴吸管稍用力均勻吹打下來。

實驗分為5組。對照組：巨噬細(xì)胞+DMEM培養(yǎng)基；模型組：巨噬細(xì)胞+ox-LDL；miR-467b mimic組：巨噬細(xì)胞+ox-LDL模型復(fù)制后參照脂質(zhì)體2000說明書轉(zhuǎn)染miR-467b mimic轉(zhuǎn)染進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞；中藥高劑量組：巨噬細(xì)胞+ox-LDL+中藥高劑量含藥血清；中藥低劑量組：巨噬細(xì)胞+ ox-LDL+中藥低劑量含藥血清。

2.2.2 建立巨噬細(xì)胞損傷模型與細(xì)胞活力檢測 將巨噬細(xì)胞混懸液(1×105mL-1)，接種于6孔板中(每孔30 000個細(xì)胞)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，篩選合適的ox-LDL加入濃度，實驗組ox-LDL濃度為5 mg/L，同時設(shè)立正常對照組及空白對照組，正常對照組為巨噬細(xì)胞加正常細(xì)胞培養(yǎng)基，空白對照組只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞[8]。以上實驗組每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，分別于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入20 μL MTT(5 mg/L)，培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入150 μL DMSO溶解MTT，振蕩器混勻后，酶標(biāo)儀490 nm測定吸光度(absorbance，A)值[8]；按下式計算：細(xì)胞的存活率=(實驗組A值-空白對照組A值)/(正常對照組A值-空白對照組A值)×100%。

選取實驗組(ox-LDL組)和正常組細(xì)胞，按照上述流程進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)束后用0.2%胰酶消化收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測實驗組和正常組細(xì)胞的增殖和凋亡[8]。

2.2.3 血清干預(yù)巨噬細(xì)胞 將第3～5代巨噬細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用PBS溫和洗3遍，分別加入中藥不同劑量含藥血清培養(yǎng)基，含藥血清作用48 h后，按Hoechst33258試劑盒說明書進(jìn)行染色，并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖和凋亡[8]。

2.2.4 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗 無菌條件下，巨噬細(xì)胞(1×105mL-1)接種于6孔板，每孔含2 mL培養(yǎng)基，孵育片刻，取miR-467b mimic 0.6 μL和HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑12 μL滴入300 μL不含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，混合均勻，使其終濃度為5 nmol/L，室溫條件下放置5～10 min，直至形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物分別均勻滴入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育至巨噬細(xì)胞的融合度約達(dá)到80%時，刮取細(xì)胞，以提取巨噬細(xì)胞的RNA和總蛋白[8]。

2.2.5 RT-PCR法檢測RAW264.7巨噬細(xì)胞中pri-miR-467b mRNA、LPL mRNA表達(dá) 收集干預(yù)后和轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞，分離提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；所采用反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性；94 ℃ 50 s，55 ℃ 55 s，72 ℃ 60 s，72 ℃ 10 min，共30個循環(huán)[8]。根據(jù)PCR反應(yīng)信號強度CT值計算每個樣本目的基因mRNA的相對表達(dá)量[8]。

2.2.6 高效液相色譜法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平 用15% KOH的醇溶液除去小鼠單核巨噬細(xì)胞樣品中三酰甘油，用6%三氯乙酸除去其中蛋白質(zhì)，然后以容積比為3∶2的正己烷與異丙醇混合溶劑提取巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇，檢測細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol，TC)、游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)和膽固醇酯(cholesterol ester，CE)的含量[9]。

2.3 體內(nèi)實驗

2.3.1 模型復(fù)制、分組與給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，ApoE-/-小鼠給予高脂飼料(含脂肪21%、膽固醇0.15%)；飼養(yǎng)4周模型復(fù)制成功(主動脈壁可見明顯的斑塊形成)后，將ApoE-/-小鼠隨機等分為模型組、miR-467b mimic組、中藥高劑量組和中藥低劑量組，C57BL/6J小鼠作為對照組，給予普通飼料。對照組小鼠每日給予0.9%生理鹽水86.4 g/kg；模型組小鼠每日灌胃給予0.9%生理鹽水86.4 g/kg。miR-467b mimic組小鼠尾靜脈注射miR-467b mimic；中藥高劑量組小鼠每日灌胃血管軟化丸86.4 g/kg；中藥低劑量組小鼠每日灌胃血管軟化丸21.6 g/kg。每日灌胃1次，連續(xù)灌胃4周。

2.3.2 樣品采集與處理 取材前對動物禁食12 h，去眼球采血，分離血清，脫頸椎處死，分離主動脈，用10%多聚甲醛固定6 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋處理后切片(6～8 μm)。

2.3.3 采用免疫組織化學(xué)法檢測主動脈LPL蛋白表達(dá)水平 取石蠟包埋處理后的切片，按照實驗流程進(jìn)行，顯微鏡下檢查并照像，切片用中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察結(jié)果。細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色，陽性信號為棕黃色或棕褐色；采用計算機影像處理和圖像分析軟件(BZ8000 analysis，美國Keyence 公司)計算光密度(optical density,OD)值。

2.3.4 RT-PCR檢測主動脈pri-miR-467b mRNA 及LPL mRNA表達(dá)水平 稱取小鼠主動脈組織的質(zhì)量后，加入適量Trizol，按試劑盒說明書提取總RNA，按步驟進(jìn)行檢測。

2.3.5 血清炎癥因子測定 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗測定血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)水平。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明操作，重復(fù)3次實驗。

3 結(jié)果

3.1 5組小鼠巨噬細(xì)胞增殖率和凋亡率比較 與對照組比較，模型組的巨噬細(xì)胞增殖率明顯小于對照組(P<0.05)，凋亡率明顯大于對照組(P<0.05)；與模型組比較，miR-467b mimic組、中藥高劑量組和中藥低劑量組小鼠巨噬細(xì)胞增殖率明顯大于模型組(P<0.05)，凋亡率明顯小于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 5組小鼠巨噬細(xì)胞增殖率和凋亡率比較

3.2 5組小鼠巨噬細(xì)胞pri-miR-467b mRNA、LPL mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組巨噬細(xì)胞pri-miR-467b mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，LPL mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，miR-467b mimic組、中藥高劑量組和中藥低劑量組巨噬細(xì)胞pri-miR-467b mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，LPL mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組小鼠巨噬細(xì)胞pri-miR-467b mRNA、LPL mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

3.3 5組小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平比較 與對照組比較，模型組巨噬細(xì)胞內(nèi)TC、CE水平明顯升高(P<0.05)，F(xiàn)C水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，miR-467b mimic組，中藥高劑量組和中藥低劑量組巨噬細(xì)胞內(nèi)TC、CE水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)C水平明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 5組小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平比較

3.4 5組小鼠主動脈pri-miR-467b mRNA、LPL mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 LPL蛋白表達(dá)陽性信號為棕黃色或棕褐色，以模型組斑塊形成處最為明顯。對照組主動脈厚薄均勻，內(nèi)膜光滑平整，各層結(jié)構(gòu)正常；模型組小鼠主動脈管徑厚薄不均勻，內(nèi)膜不光滑，有明顯的AS斑塊形成，可見大量棕黃色顆粒，呈陽性表達(dá)；miR-467b mimic組AS斑塊不明顯，棕黃色顆粒較少；中藥高劑量組和低劑量組小鼠主動脈各層結(jié)構(gòu)清晰，血管細(xì)胞排列較整齊，AS病變程度明顯輕于模型組，棕黃色顆粒較少。與對照組比較，模型組小鼠主動脈pri-miR-467b mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，LPL mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，miR-467b mimic組、高劑量組和低劑量組小鼠主動脈pri-miR-467b mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)、LPL mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖1、表4。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測5組小鼠主動脈組織LPL蛋白的表達(dá)水平(DAB染色，10×20倍)

表4 5組小鼠主動脈pri-miR-467b mRNA、LPL mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

3.5 5組小鼠血清炎癥因子水平比較 與對照組比較，模型組血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，miR-467b mimic組、高劑量組和低劑量組血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平明顯降低(P<0.05)。見表5。

表5 5組小鼠血清炎癥因子水平比較

4 討論

AS的發(fā)病過程主要有“脂質(zhì)浸潤學(xué)說”和“炎癥損傷反應(yīng)學(xué)說”。LPL是水解血漿乳糜微粒和低密度脂蛋白中三酰甘油的限速酶，LPL作為脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶，能夠降低血漿三酰甘油水平，并增加高密度脂蛋白膽固醇水平，加速肝臟對脂蛋白的清除[10]。血漿中極低密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和脂蛋白殘粒侵入血管壁沉積聚集，在單核細(xì)胞能夠分化為巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞吞噬大量脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞，泡沫化的巨噬細(xì)胞能夠?qū)е耇NF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1等炎癥因子分泌，進(jìn)而引起炎癥細(xì)胞黏附、浸潤和基質(zhì)降解，導(dǎo)致AS斑塊破裂[3，11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-467b類似物或抑制劑至RAW264.7巨噬細(xì)胞后，能夠降低脂質(zhì)沉積和IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1的分泌，減少巨噬細(xì)胞泡沫化，表明巨噬細(xì)胞中miR-467b可能靶向調(diào)控LPL抑制AS的發(fā)生發(fā)展。

中醫(yī)學(xué)對AS的認(rèn)識最早可追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)》。書中有“血濁”一詞，高脂血癥可歸屬于中醫(yī)“血濁”范疇，血濁可致痰、瘀甚至毒等病理產(chǎn)物的產(chǎn)生，壅塞脈道，沉積脈壁，形成AS，若使痰瘀蓄留不去而成“脈痹”，即血栓形成。本課題組結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床實踐，確定痰阻血瘀是AS的主要證型。血管軟化丸由保和丸加減化裁而成。方中山楂酸甘，性微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有消食化積、行氣散瘀的功效，為君藥；神曲甘辛，性溫，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾開胃、和中止瀉的功效；萊菔子辛甘，性平；歸肺、脾、胃經(jīng)，具有消食除脹、降氣化痰的功效；半夏辛溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有燥濕化痰、消痞散結(jié)的功效；茯苓味甘，性平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有滲濕、健脾的功效；郁金味辛苦，性寒，歸肝、膽、心經(jīng)，具有行氣解郁、涼血破瘀、降血脂的功效；三七味甘、微苦，性溫，歸肝、胃經(jīng)，具有化瘀止血、活血定痛的功效；枸杞子滋補肝腎、益精明目；珍珠母和代赭石平肝潛陽、降逆祛痰，共為臣藥；陳皮辛苦，性溫，歸脾、肺經(jīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏消積化痰、活血化瘀之功[7]。既往臨床研究[13-15]表明，血管軟化丸能夠通過抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)血脂，改善血管內(nèi)皮功能，抑制AS發(fā)展，也能夠促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，動物實驗發(fā)現(xiàn)，血管軟化丸通過調(diào)控TLR9介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化效應(yīng)，抑制AS的發(fā)生發(fā)展[5]。課題組研究發(fā)現(xiàn)，血管軟化丸抑制AS形成的作用機制可能與調(diào)控miRNA-126影響下游炎癥因子GRS16、基質(zhì)細(xì)胞源性因子12(CXCL12)及其受體4(CXCR4)、血管細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)[16]，調(diào)控CD40-CD40L系統(tǒng)抑制血小板活化有關(guān)[17]。

本研究結(jié)果顯示，血管軟化丸能提高巨噬細(xì)胞中pri-miR-467b mRNA表達(dá)水平，降低巨噬細(xì)胞中LPL mRNA和蛋白表達(dá)水平，降低巨噬細(xì)胞內(nèi)TC、CE水平。體內(nèi)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管軟化丸能夠提高主動脈pri-miR-467b mRNA表達(dá)水平，降低主動脈LPL mRNA和蛋白表達(dá)，降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平，抑制AS的發(fā)生發(fā)展。本研究初步表明，化痰祛瘀中藥復(fù)方血管軟化丸具有調(diào)節(jié)血脂、抗感染作用，其抑制AS的分子機制可能與調(diào)控miR-467b，進(jìn)而靶向LPL調(diào)控巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，減少IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1等炎癥因子分泌有關(guān)。