孟 杰，蘇 瑞，廖 赟，袁 波，李 玲

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院，上海 200336)

鉤藤(Uncariarhynchophylla)作為傳統(tǒng)中藥在中國已有悠久的使用歷史，為茜草科鉤藤屬[1]。鉤藤具有清熱平肝、息風(fēng)定驚的功效，主要用于治療癲癇及頭痛眩暈等癥[2]。鉤藤中主要的活性成分為吲哚類生物堿，約占鉤藤含量的0.2%，而在這些生物堿中以鉤藤堿含量最高，占28%～50%，其余生物堿還包括去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、柯諾辛堿等[3-4]?，F(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究表明，鉤藤堿主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、降壓及保護(hù)腦缺血等作用[5-8]，具有廣闊的開發(fā)前景。

人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞(the human colon adenocarcinoma cell line，Caco-2)單層模型中，培養(yǎng)成熟的細(xì)胞可形成細(xì)胞極性和致密單層。Caco-2細(xì)胞單層模型的結(jié)構(gòu)和功能與機(jī)體小腸上皮細(xì)胞十分相近，還有微絨毛、緊密連接等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體和酶系[9]。完全分化的Caco-2細(xì)胞單層已經(jīng)被廣泛地確定為一種可以使用的體外模型，經(jīng)常用來評價藥物的跨膜吸收、胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)及受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)[10-11]。

為了對鉤藤堿作進(jìn)一步的開發(fā)，本實驗首次采用液相色譜-質(zhì)譜法對鉤藤堿在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)特性進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 藥物與試劑 鉤藤堿(純度98.0%，批號ST07840120)：上海詩丹德生物科技有限公司；胎牛清(fetal bovine serum, FBS)：美國Gibco公司；維拉帕米(批號 HY-A0064)、普萘洛爾(批號 HY-B0573)：MCE中國公司；乙腈(批號 10965929833)、甲醇(批號 109993335909)：德國Merck公司。

1.2 主要儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀、SPD型紫外檢測器：美國安捷倫科技有限公司；XS205DU型十萬分之一電子天平：德國Mettler Toledo公司；KQ-300DB數(shù)控超聲儀：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司。

2 方法

2.1 Caco-2細(xì)胞模型的建立 按照文獻(xiàn)[12]方法建立Caco-2細(xì)胞模型。采用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺以及1%青鏈霉素)于37 ℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時，加入0.25%胰酶-EDTA消化，調(diào)整Caco-2細(xì)胞密度為5×104/mL。將細(xì)胞接種在Transwell小室進(jìn)行生長，細(xì)胞刷狀緣側(cè)(apical，AP)加容積為0.4 mL的懸浮液，細(xì)胞基底側(cè)(basolateral, BL)加入0.6 mL培養(yǎng)液，在第1周內(nèi)，隔天換液，從第2周開始，每日換液，在第21天時，即可進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)實驗。在這一過程中測定跨上皮電阻值(transepithelial electrical resistance, TEER)。觀測Caco-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，測定Caco-2細(xì)胞單層TEER值以及腸刷狀緣細(xì)胞標(biāo)志酶——堿性磷酸酶的活性，建立并驗證Caco-2細(xì)胞模型。

2.2 細(xì)胞毒性實驗 取對數(shù)生長的Caco-2細(xì)胞，設(shè)置為每孔1 000個細(xì)胞，放入96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)24 h后，使用Hank平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution, HBSS)潤洗細(xì)胞，加入不同劑量的藥物，每個劑量設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)4 h。結(jié)束孵育后，每孔加入CCK8 10 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，其測定吸收波長為490 nm。實驗中另設(shè)不加細(xì)胞的空白對照組，以及只加細(xì)胞不加任何藥物樣品溶液的陰性對照組。根據(jù)測得的吸光度，計算細(xì)胞存活率。

2.3 鉤藤堿溶液的配制 精密稱取3.56 mg的鉤藤堿樣品于1.5 mL EP管中，之后添加185.2 μL DMSO溶劑溶解，渦旋3 min，1 000 r/min離心3 min，配置成濃度50 mmol/L的儲存液，溶液中DMSO濃度低于0.1%，-20 ℃保存。實驗操作當(dāng)日，從50 mmol/L中取10 μL，加入10 μL 100% DMSO，然后用HBSS稀釋成500、250、125、62.5、31.25、15.63 μmol/L鉤藤堿溶液。

2.4 分析樣品處理 精密量取鉤藤堿跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)液100 μL，加甲醇900 μL稀釋，超聲5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液。

2.5 液相色譜-質(zhì)譜分析

2.5.1 液相色譜條件 Waters SB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫(0～2 min，15%～15% A；2～5 min，15%～50% A；5～5.1 min，50%～90% A；5.1～6.5 min，90%～90% A；6.5～7 min；90%～15% A；7～9 min，15%～15% A)；運(yùn)行時間：9 min；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：4 ℃。

2.5.2 質(zhì)譜檢測參數(shù) 電噴霧電離(ESI源)，正離子模式，多反應(yīng)檢測掃描，離子源溫度500 ℃，離子化電壓5 000 V，霧化氣(GS1)345 kPa，輔助氣(GS2)345 kPa，用于定量分析的化合物為鉤藤堿檢測離子對，m/z為385.21→178.1。

2.6 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實驗 用HBSS緩沖液將培養(yǎng)21 d的Caco-2單層細(xì)胞膜沖洗3次，最后1次在37 ℃培養(yǎng)箱中平衡20 min。①AP→BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)。將各濃度的鉤藤堿溶液 0.4 mL加到細(xì)胞AP側(cè)作為供給池，同時BL側(cè)加入空白的HBSS溶液0.6 mL作為接受池。②BL→AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)。將各濃度的鉤藤堿溶液0.6 mL加到BL側(cè)作為供給池，同時AP側(cè)加入空白HBSS溶液0.4 mL作為接受池。置于37 ℃、55 r/min的恒溫?fù)u床上孵育，分別于載藥后30、60、90、120 min 于接收液側(cè)采樣100 μL，同時補(bǔ)加相同容積HBSS緩沖液，每組平行3個孔，計算鉤藤堿在Caco-2細(xì)胞單層累積轉(zhuǎn)運(yùn)量(ΔQ)及表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient, Papp)。③P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抑制劑(維拉帕米)對轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。抑制劑溶液與藥物溶液采用HBSS溶液同時進(jìn)行配制，其中鉤藤堿濃度為125 mol/L，抑制劑溶液濃度為200 μmol/L。然后分別加入到AP側(cè)(0.4 mL)和BL側(cè)(0.6 mL)，分別在30、60、90、120 min于接受池取樣100 μL，并加入100 μL空白HBSS溶液補(bǔ)足液體。樣品于-40 ℃條件下保存。

Papp大小反映藥物透過單層細(xì)胞的能力以及藥物吸收的速度、程度。它可由以下公式計算:

Papp=ΔQ/(Δt×A×c0)

式中Papp的計量單位是cm/s；Q是累積轉(zhuǎn)運(yùn)量，代表化合物在接收端出現(xiàn)的總量，計量單位是μmol；ΔQ/Δt是接受端藥物出現(xiàn)的速率(ΔQ為Δt內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量)，計量單位是μmol/s；c0是化合物在供給端的初始濃度，計量單位是mmol/L；A是聚碳酯膜的表面積，計量單位是cm2。

3 結(jié)果

3.1 Caco-2細(xì)胞模型的建立和驗證 依照正常細(xì)胞的培養(yǎng)順序培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞單層，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)第3周后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長速度較為均勻，邊界十分明顯，細(xì)胞之間出現(xiàn)很好的連接狀態(tài)。選擇種板后第3、6、9、12、15、18、20、21天測量電阻值。Caco-2細(xì)胞單層的完整程度使用TEER進(jìn)行測評，通常高于500 Ω·cm2就能夠看做單層致密較為完整[13]。至第21天，TEER值升至(984.45±55.15)Ω·cm2。在第3周時，兩側(cè)堿性磷酸酶活力達(dá)到5.10±0.07，通過AP與BL比值看出，堿性磷酸酶在AP側(cè)的活性顯著高于BL側(cè)，即產(chǎn)生了極化現(xiàn)象[13]。15 d后趨勢變緩，AP側(cè)與BL側(cè)細(xì)胞分化明顯，達(dá)到轉(zhuǎn)運(yùn)實驗的需求。

3.2 細(xì)胞毒性實驗 125 μmol/L鉤藤堿處理Caco-2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為95%，說明鉤藤堿對Caco-2細(xì)胞無明顯殺傷作用。因此本實驗采用31.25、62.5、125 μmol/L鉤藤堿溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)研究。

3.3 方法學(xué)研究

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 選取鉤藤堿對照品，精密測量，放置在容積為25 mL容量瓶內(nèi)，用甲醇溶解，定容至刻度，配置成濃度為1 000、500、200、100、50 ng/mL的溶液，取10 μL進(jìn)樣，依照“2.5”項下色譜條件進(jìn)行測定。以鉤藤堿濃度(ρ)對峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：A=2 360.132 71ρ+3.488 56×105(r=0.999 59)，線性范圍為57.816～1 156.32 ng/mL，線性關(guān)系良好。

3.3.2 精密度考察 測定鉤藤堿高、中、低3種不同濃度的對照品溶液，日內(nèi)精密度為2.12%～4.21%；日間精密度為2.74%～5.66%，均小于15%，符合生物樣品檢測要求。

3.3.3 回收率試驗 取鉤藤堿對照品溶液，使用甲醇稀釋成濃度為1 000、400、100 ng/mL的對照品溶液，在設(shè)定好的色譜條件下進(jìn)行檢測，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出鉤藤堿濃度。以檢測濃度與配制濃度之間的比例，計算回收率。鉤藤堿方法低濃度(115.632 ng/mL)的回收率為100.71%±7.05%，中濃度(462.528 ng/mL)的回收率為104.34%±3.32%，高濃度(1 156.32 ng/mL)的回收率為106.21%±2.05%，均滿足生物樣本分析要求。用乙腈配制濃度分別為115.632、462.528、1 156.32 ng/mL的鉤藤堿溶液，記為Set1；空白HBSS溶液經(jīng)過前處理后，配制濃度為115.632、462.528、1156.32 ng/mL的鉤藤堿溶液，記為Set2；含有鉤藤堿濃度分別為115.632、462.528、1 156.32 ng/mL的HBSS溶液，經(jīng)過前處理后，得到鉤藤堿溶液，記為Set3。提取回收率采用Set3/Set2進(jìn)行計算，基質(zhì)效應(yīng)采用Set2/Set1進(jìn)行計算。結(jié)果顯示，低、中、高濃度組樣品的提取回收率分別為98.21%、97.28%、95.46%，而基質(zhì)效應(yīng)分別為94.5%、93.7%、95.4%，并且前1 min不進(jìn)色譜系統(tǒng)，對本實驗無影響。結(jié)果均滿足生物樣本測定的條件。

3.3.4 穩(wěn)定性考察 使用400 ng/mL鉤藤堿對照品溶液，在0 h進(jìn)樣分析后，分別于第1、2、4、6、12、24小時進(jìn)行測定，計算各時間點待測成分峰面積回收率及峰面積RSD，每次進(jìn)樣1 L，鉤藤堿峰面積RSD<15%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。同時對低、中、高濃度組樣品的室溫穩(wěn)定性(25 ℃保存24 h)、長期穩(wěn)定性(-40 ℃保存1個月)及反復(fù)3次凍融(-40 ℃)進(jìn)行了考察，結(jié)果均顯示RSD<15%。符合生物樣品檢測要求。

3.3.5 定量限考察 采用逐級稀釋法，測定其鉤藤堿定量限為2 ng(S/N=10.3)。

3.3.6 專屬性考察 依照“2.5” 項下色譜條件進(jìn)行測定，得到色譜圖(見圖1)。結(jié)果表明，空白甲醇溶液、含有鉤藤堿的Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)液、鉤藤堿對照品、加有鹽酸維拉帕米和鉤藤堿的Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)液的檢測結(jié)果均無干擾，表明本方法的專屬性良好。

注：A.空白甲醇溶液；B.含有鉤藤堿的Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)液；C.鉤藤堿對照品；D.加有鹽酸維拉帕米和鉤藤堿的Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)液

3.4 轉(zhuǎn)運(yùn)方向、時間和濃度對鉤藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 轉(zhuǎn)運(yùn)方向、鉤藤堿濃度、轉(zhuǎn)運(yùn)時間對鉤藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響見表1。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行三因素一元定量資料的方差分析，分析結(jié)果見表2。結(jié)果表明轉(zhuǎn)運(yùn)方向、鉤藤堿濃度及轉(zhuǎn)運(yùn)時間對鉤藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。組間比較顯示，隨著時間的延長，轉(zhuǎn)運(yùn)量逐漸趨于飽和，其中從30 min到60 min，轉(zhuǎn)運(yùn)量差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而從60 min到120 min時，轉(zhuǎn)運(yùn)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著濃度的增加，轉(zhuǎn)運(yùn)量增加，其中從31.25 μmol/L至125 μmol/L 濃度，轉(zhuǎn)運(yùn)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明隨著濃度的升高，轉(zhuǎn)運(yùn)量逐漸趨于飽和。從表3可知，鉤藤堿從BL側(cè)到AP側(cè)的外排速率明顯高于從AP側(cè)到BL側(cè)的吸收速率。

表1 不同濃度、不同孵育時間及不同給藥部位下鉤藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)量

表2 鉤藤堿濃度、孵育時間及給藥部位對鉤藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)量影響的三因素方差分析結(jié)果

表3 不同濃度及轉(zhuǎn)運(yùn)方向狀態(tài)下鉤藤堿的Papp值

3.5 蛋白抑制劑對鉤藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 鉤藤堿(125 μmol/L)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp(BL→AP)顯著高于Papp(AP→BL)值，且外流比為2.040，說明鉤藤堿主要以主動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式跨膜吸收，且外排轉(zhuǎn)運(yùn)體可能參與藥物在Caco-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)P-gp抑制劑維拉帕米(100 μmol/L)與鉤藤堿(125 μmol/L)共存時，鉤藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)量的變化見表4。當(dāng)加入P-gp抑制劑之后，藥物由BL側(cè)向AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著減少，而由AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著增加，說明P-gp參與了藥物的外排作用。對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行兩因素方差分析(見表5)，結(jié)果顯示P-gp抑制劑維拉帕米對鉤藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明P-gp參與了藥物在Caco-2細(xì)胞中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。加入抑制劑后，鉤藤堿的Papp見表6。

表4 蛋白酶抑制劑維拉帕米、孵育時間、給藥部位對鉤藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響

表5 孵育時間及轉(zhuǎn)運(yùn)方向?qū)︺^藤堿轉(zhuǎn)運(yùn)量影響的兩因素方差分析結(jié)果

表6 蛋白抑制劑對鉤藤堿Papp的影響

3.6 陽性對照藥普萘洛爾和阿替洛爾的轉(zhuǎn)運(yùn) 在本實驗環(huán)境下，Caco-2細(xì)胞單層模型中呈良好吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的陽性對照藥普萘洛爾的Papp為(2.69±0.43)×10-5cm/s，吸收良好，呈難轉(zhuǎn)運(yùn)的陽性對照藥阿替洛爾的Papp值為(2.58±0.14)×10-7cm/s，與文獻(xiàn)[14-15]的結(jié)果一致。鉤藤堿在31.25、62.5、125 μmol/L濃度下Papp為10-6cm/s。

4 討論

對鉤藤中鉤藤堿及其他系列生物堿含量測定時，色譜條件的選擇可以使用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)對照品質(zhì)譜響應(yīng)和待分析物差異較大，且穩(wěn)定性也欠佳，對照品和內(nèi)標(biāo)物的分離度不理想，故采用外標(biāo)法。

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在 Caco-2細(xì)胞膜上，可以探究載體所提供的藥物攝取以及排泄機(jī)制。Caco-2 細(xì)胞所表達(dá)的P-gp[16]、多藥耐藥蛋白-2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)[17]和乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)[18]濃度和正常人體空腸所表現(xiàn)出來的濃度一致[19]。除此之外，在Caco-2細(xì)胞頂膜中也有所表達(dá)，這也證實了在Caco-2細(xì)胞系中的極化表達(dá)[20]。

確立快速準(zhǔn)確的檢測分析手段是確保該實驗可以如期完成的前提條件。本實驗運(yùn)用高效液相色譜法檢測Caco-2細(xì)胞模型HBSS液中鉤藤堿，出峰時間達(dá)到了4.25 min，無顯著的 Caco-2模型內(nèi)溶液干擾。鉤藤堿在57.816～1 156.32 ng/mL范圍內(nèi)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的線性關(guān)系良好，回收率達(dá)到90%以上，日內(nèi)以及日間RSD均小于6%，并且在溫度為(37±1)℃的實驗條件下穩(wěn)定，滿足樣品實驗的需要。這一檢測手段具有靈敏度高、檢測速度快的優(yōu)勢。

鉤藤堿(31.25、62.5、125 μmol/L)在Caco-2細(xì)胞雙向轉(zhuǎn)運(yùn)中的Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)值均大于1.5[21-22]，說明鉤藤堿的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律中有外排蛋白的參與。在ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中，P-gp、MRP2、BCRP是被研究最深入的幾種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[23]。通常情況下，口服藥物需要經(jīng)過小腸這一器官代謝達(dá)到血液以及組織中，上述所提到的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有屏障作用，能夠?qū)⑺幬锿馀湃肽c腔。

在Caco-2細(xì)胞模型中，經(jīng)常運(yùn)用Papp來測評藥物口服吸收的程度。目前以Papp評價藥物吸收程度的標(biāo)準(zhǔn)[24]：Papp<1×10-6cm/s，吸收率為0～20%，難吸收；10-6cm/s10-5cm/s，吸收率為70%～100%，吸收良好。因此，鉤藤堿的吸收良好，可以開發(fā)成口服制劑，值得進(jìn)行深入研究。通過設(shè)定不同時間點(0、30、60、90、120 min)的研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨著時間的增加而增加，于60 min 時吸收顯著增強(qiáng)，Papp(BL→AP)均顯著高于Papp(AP→BL)。此外，不同濃度(31.25、62.5、125 μmol/L)鉤藤堿的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)程度隨濃度升高而增加，且Papp(BL→AP)顯著高于Papp(AP→BL)，說明藥物在吸收過程中以主動轉(zhuǎn)運(yùn)為主，且一定有外排蛋白的參與。P-gp蛋白抑制劑維拉帕米可顯著降低鉤藤堿從BL側(cè)至AP側(cè)的Papp值，增加從AP側(cè)至BL側(cè)的Papp值，鉤藤堿的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律中有外排蛋白的參與，提示鉤藤堿為外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的底物。