蔣旭，崔會(huì)婷，王珍，張鐵軍，龍瑞才，楊青川，康俊梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿是世界上最重要的豆科牧草之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)一直是苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展所關(guān)注的熱點(diǎn)。影響苜蓿品質(zhì)的主要因素有纖維素、木質(zhì)素和粗蛋白含量以及能量等，其中木質(zhì)素和纖維素含量是影響苜蓿消化率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要因素之一。木質(zhì)素和纖維素是組成植物細(xì)胞壁的主要成分，占植物總生物量的絕大部分，對(duì)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育非常重要。對(duì)牧草而言，纖維素與木質(zhì)素含量的多少?zèng)Q定牧草消化率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低，牧草木質(zhì)化程度越高，其消化率越低，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也越低[1-2]。因此，研究苜蓿細(xì)胞壁生物合成途徑中關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能，為揭示苜蓿纖維素與木質(zhì)素合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為利用基因工程的方法改善紫花苜蓿品質(zhì)提供參考。【前人研究進(jìn)展】纖維素與木質(zhì)素是由單體聚合而成的大分子有機(jī)物質(zhì)，從單體的合成到聚合均有一系列基因參與完成，從而使植物細(xì)胞壁物質(zhì)合成通路具有多基因調(diào)控的特性（圖1）。通過(guò)對(duì)擬南芥等植物木質(zhì)素、纖維素生物合成機(jī)制的研究表明，植物NST轉(zhuǎn)錄因子是次生細(xì)胞壁物質(zhì)合成的總開(kāi)關(guān)，對(duì)細(xì)胞壁生物合成起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[3-5]。擬南芥中存在3個(gè)NST同源基因，NST1和NST2、NST3之間功能存在冗余，共同調(diào)控次生壁發(fā)育，NST1和NST2基因調(diào)節(jié)擬南芥花藥內(nèi)壁細(xì)胞次生壁發(fā)育，并對(duì)花藥正常開(kāi)裂起到關(guān)鍵作用[6]；NST1、NST3調(diào)控木質(zhì)部與束間纖維細(xì)胞次生壁的合成[4-5]；ZHONG等研究擬南芥三突變體nst1nst2nst3，結(jié)果表明突變體莖木質(zhì)部與纖維細(xì)胞次生壁完全缺失，造成植株倒伏[7]，暗示NST對(duì)木質(zhì)素和纖維素合成具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，NST轉(zhuǎn)錄因子主要通過(guò)激活靶基因啟動(dòng)子區(qū) SNBE元件（Secondary wall NAC binding element）調(diào)控基因表達(dá)[8]。降低擬南芥NST1和NST3表達(dá)量，次生壁物質(zhì)合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量受到了不同程度的下調(diào)[4-5]。例如，nst1nst3雙突變體中4-香豆酸輔酶A連接酶基因（4CL1），咖啡酰輔酶連接酶基因（COMT1），纖維素合酶亞基基因（CesA7, CesA8）等參與次生壁木質(zhì)素與纖維素物質(zhì)合成基因表達(dá)量顯著下調(diào)[5]。單子葉植物玉米中過(guò)表達(dá)ZmNST3/4后能夠激活一系列纖維素與木質(zhì)素相關(guān)合成基因CesA4、CesA9、4CL、HCT的表達(dá)，從而調(diào)控玉米次生壁纖維素與木質(zhì)素合成[9]。植物次生細(xì)胞壁物質(zhì)合成也會(huì)受到激素信號(hào)的誘導(dǎo)[10]。赤霉素（gibberellin，GA）是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素之一，GA通過(guò)誘導(dǎo)植物體內(nèi)酚類化合物等次生代謝來(lái)調(diào)節(jié)木質(zhì)素的合成[11]。研究表明，GA信號(hào)通路的主要調(diào)控方式是通過(guò)誘導(dǎo)DELLA蛋白降解完成的[12]。水稻中GA通過(guò)解除DELLA蛋白OsSLR1對(duì)NAC29/31、MYB103L等次生壁轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的抑制作用，從而激活NAC-MYB次生壁合成通路，促進(jìn)纖維素合成[13-14]。水楊酸（salicylicacid，SA）是植物內(nèi)源激素，對(duì)長(zhǎng)春花幼苗外源施加水楊酸能夠增加PAL、POD酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞壁木質(zhì)化程度提高，增強(qiáng)植物的抗逆性，以抵御不良環(huán)境脅迫[15]。生產(chǎn)實(shí)踐中用多效唑（paclobutrazol，PCB）作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)增加莖稈木質(zhì)素含量，增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度，防止倒伏[16]。小麥苗期用PCB處理，小麥株高降低，基部莖稈細(xì)胞壁加厚，木質(zhì)素與纖維含量上升，增強(qiáng)了小麥的抗逆性[17]。由此可見(jiàn)，外源激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)木質(zhì)素和纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)促進(jìn)植物細(xì)胞壁合成有重要的調(diào)節(jié)作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】NST轉(zhuǎn)錄因子已在擬南芥、玉米和楊樹(shù)等植物中開(kāi)展大量研究，結(jié)果表明NST通過(guò)激活植物次生壁木質(zhì)素和纖維素合成途徑中一系列相關(guān)基因的表達(dá)，從而對(duì)木質(zhì)素和纖維素合成起重要的調(diào)節(jié)作用。紫花苜蓿是優(yōu)質(zhì)飼草，木質(zhì)素和纖維素含量是影響苜蓿消化率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要因素之一，然而苜蓿中關(guān)于NST轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控木質(zhì)素與纖維素合成的分子機(jī)制鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以紫花苜蓿為研究對(duì)象，克隆了MsNST轉(zhuǎn)錄因子，分析了其在外源激素誘導(dǎo)下的表達(dá)模式；通過(guò)在擬南芥和苜蓿中超表達(dá)MsNST，解析了該基因?qū)俎＜?xì)胞壁中纖維素和木質(zhì)素合成以及總糖含量的影響，為揭示細(xì)胞壁物質(zhì)合成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

圖1 纖維素與木質(zhì)素合成途徑示意圖Fig. 1 Cellulose and lignin biosynthesis pathway

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)

紫花苜蓿中苜1號(hào)（Medicago sativaL. Zhongmu No.1）、擬南芥（Col生態(tài)型）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)北京畜牧獸醫(yī)研究所飼草遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。紫花苜蓿種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽3d，移栽到1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中置于植物生長(zhǎng)間培養(yǎng)（16 h光照 / 8 h黑暗，溫度25℃，濕度60%—70%）。培養(yǎng)30d進(jìn)行脅迫處理，分別以 20 μmol GA3、250 μmol SA、10 μmol PCB處理12 h，每隔4 h取全部莖段，立即投入液氮冷凍，保存在-80℃冰箱，不處理為對(duì)照，每個(gè)處理 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。擬南芥種子經(jīng)過(guò)1%升汞消毒，滅菌水清洗7次，播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周（16 h光照 / 8 h黑暗，22℃，濕度60%—70%），然后移栽到土壤（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1）中生長(zhǎng)7周用于后續(xù)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿通過(guò)扦插擴(kuò)繁觀察表型并進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。本研究始于2018年開(kāi)始，所有試驗(yàn)均在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)北京畜牧獸醫(yī)研究所飼草遺傳育種實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 MsNST的克隆

紫花苜蓿總RNA提取參考植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作（Promega，上海普洛麥格生物技術(shù)有限公司）。取1μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，北京六合通生物技術(shù)有限公司）反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。由蒺藜苜蓿MtNST1全長(zhǎng)CDS序列（GenBank: GU144511.1）為參考，分別在 5′UTR 與 3′UTR 區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物MsNST-f/r （表1），以紫花苜蓿cDNA為模板克隆MsNST，通過(guò)測(cè)序獲取MsNST全長(zhǎng)CDs序列（北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI的ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)最大開(kāi)放閱讀框；利用ExASy（https://web.expasy.org/cgi-bin/computepi）預(yù)測(cè)MsNST蛋白分子量大小、理論等電點(diǎn)和親水性；利用Protscale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org/）以擬南芥NAC1為模板預(yù)測(cè)MsNST蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位分析；利用DNAMAN軟件（version 7.0.2）對(duì)MsNST序列與擬南芥NST1-3序列進(jìn)行相似性比對(duì)；利用MEGA 6.0軟件通過(guò)鄰接法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 GA3、SA、PCB誘導(dǎo)下MsNST表達(dá)分析

分別取 GA3、SA、PCB誘導(dǎo)下各處理的樣品提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)基因的序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物qNST-f/r（表1），以紫花苜蓿β-Actin 2為內(nèi)參，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MsNST基因的表達(dá)水平。

1.5 過(guò)表達(dá)載體PBI121-MsNST的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

利用W-NST-F/R為上下游引物擴(kuò)增帶有特殊同源臂的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物與PBI121過(guò)表達(dá)載體連接，并轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，采用花序浸染法對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。另外，將PBI121-MsNST質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，以紫花苜蓿葉片為外植體，采用根癌農(nóng)桿菌侵染法進(jìn)行轉(zhuǎn)化[22]。

1.6 擬南芥中過(guò)表達(dá)MsNST轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

為了篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，將 T0代擬南芥種子用1%升汞消毒后種在含kan（50 mg·L-1）的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，篩選kan抗性擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，設(shè)計(jì)一對(duì)引物Ntest-f/r（表1）進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株鑒定。為了探索過(guò)表達(dá)MsNST對(duì)擬南芥下胚軸發(fā)育的影響，將T2代擬南芥種子消毒后，播種在1/2 MS固體平板上，分別在避光和正常光照條件下生長(zhǎng)，挑選20株長(zhǎng)勢(shì)一致的擬南芥株系，其中10株置于同一個(gè)平板上，每隔1d統(tǒng)計(jì)每株下胚軸長(zhǎng)度，共統(tǒng)計(jì)5d；另外10株置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到7周齡，分別對(duì)株高、鮮重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。同時(shí)，將7周齡擬南芥莖基部第一節(jié)用刀片截成0.5cm的莖段，放入75%酒精中真空抽氣10min，室溫放置5 h固定，將材料轉(zhuǎn)入包埋劑中室溫放置過(guò)夜。用冷凍切片機(jī)（萊卡Y470）將莖部橫切，切片厚度為50μm，置于載玻片上，加一滴1%間苯三酚于切片上室溫染色2min，然后再加一滴40%濃鹽酸進(jìn)行顯色，甘油封片后在光學(xué)顯微鏡（Olympus FV500，日本）下觀察拍照。

1.7 纖維素與木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

分別取過(guò)表達(dá)MsNST的紫花苜蓿與擬南芥轉(zhuǎn)基因植株莖組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物qNST-f/r（表1），以β-Actin為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因株系中MsNST的相對(duì)表達(dá)水平。選取表達(dá)量最高的株系檢測(cè)與纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)合成基因的表達(dá)量變化，其中紫花苜蓿分別為MsCesA3，MsCesA6，MsCesA7，MsPAL，Ms4CL，MsCoMT，擬南芥為AtPAL1、At4CL1、AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8（引物見(jiàn)表1），每個(gè)反應(yīng)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.8 總糖、結(jié)晶纖維素和木質(zhì)素含量測(cè)定

取生長(zhǎng)7周齡轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥各10株，分別置于牛皮紙袋放入鼓風(fēng)干燥箱烘干至恒重（80℃），利用組織研磨儀將樣品粉碎（振動(dòng)頻率為70Hz）。分別稱取約300 mg粉末，參考Foster方法進(jìn)行粗細(xì)胞壁分離（cell wall resider，CWR），測(cè)定木質(zhì)素含量[23]。稱取100 mg CWR置于試管中，加入72 % 濃硫酸，冰浴30 min，12 000 r/min離心，將上清液稀釋10倍，采用植物結(jié)晶纖維素檢測(cè)試劑盒（Solarbio, 北京索萊寶科技有限公司）測(cè)定纖維素的含量。分別稱取5 mg CWR，用72 %濃硫酸室溫水解20 min，用蒸餾水將硫酸濃度稀釋到4 %，加熱到121℃水解1 h，利用蒽酮比色法測(cè)定總糖含量，以上試驗(yàn)均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 MsNST的克隆及生物信息學(xué)分析

同源克隆獲得MsNST的cDNA序列為1 121bp，最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?45bp，編碼314個(gè)氨基酸（圖2）；Blast結(jié)果表明，該基因與其它物種的NST同源，故將該基因命名為MsNST；ExASy在線預(yù)測(cè)MsNST蛋白分子量為36.25 kD，理論等電點(diǎn)為6.84；MsNST全部氨基酸的平均親水系數(shù)為-0.986，表明其為親水性蛋白質(zhì)（圖3-A）；TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖 3-B）。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，占總體的60.83 %，α螺旋占17.52 %，β折疊占4.14 %，轉(zhuǎn)角為17.52 %（圖3-C）。以擬南芥NAC1蛋白為模板模擬蛋白三維結(jié)構(gòu)并建模，結(jié)果表明 MsNST可能是通過(guò)形成中心對(duì)稱的二聚體結(jié)構(gòu)行使功能（圖3-D）；通過(guò)Cell-PLoc 2.0軟件預(yù)測(cè)，該蛋白定位在細(xì)胞核上（圖3-E）。

MsNST與擬南芥3個(gè)NST氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)表明，MsNST與擬南芥AtNST1的相似性較高為55.9%，與AtNST2和AtNST3的相似性分別為51.6%、49%。MsNST的N端序列保守，具有NAC 類轉(zhuǎn)錄因子特有的5個(gè)保守亞結(jié)構(gòu)域[24]，而C端序列不保守（圖4）。進(jìn)化樹(shù)分析表明，MsNST與豆科模式植物蒺藜苜蓿MtNST1的親緣關(guān)系最近，不同物種進(jìn)化樹(shù)分為單子葉與雙子葉2大類，MsNST分布在雙子葉植物分支中，表明NST轉(zhuǎn)錄因子在雙子葉和單子葉植物中存在進(jìn)化差異（圖5）。

圖2 紫花苜蓿MsNST的克隆Fig. 2 Cloning of MsNST from alfalfa

圖3 MsNST生物信息學(xué)分析Fig. 3 Bioinformatics analysis of MsNST

圖4 MsNST和AtNST1,2,3的氨基酸序列比對(duì)Fig. 4 Amino acid alignment of MsNST and AtNST1, 2, and 3

圖5 不同植物NST基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic analysis of NSTs from different plant species

2.2 不同誘導(dǎo)條件下MsNST的表達(dá)分析

植物激素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了揭示施加外源激素對(duì)MsNST表達(dá)的調(diào)控作用，本研究分別用赤霉素、多效唑和水楊酸處理紫花苜蓿，分析MsNST受激素誘導(dǎo)后的表達(dá)特性，結(jié)果表明，GA3處理會(huì)誘導(dǎo)MsNST表達(dá)量上調(diào)，在誘導(dǎo)12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高水平，為對(duì)照的2.19倍（圖6-A）。施加PCB誘導(dǎo)結(jié)果表明，在PCB誘導(dǎo)初期，MsNST基因表達(dá)量下調(diào)在4h時(shí)達(dá)到最低水平，是未處理的0.72倍，隨后表達(dá)量上調(diào)，在誘導(dǎo)12h達(dá)到最高表達(dá)水平，為對(duì)照的3.65倍（圖6-B）。施加SA誘導(dǎo)初期，在4h時(shí)表達(dá)量顯著降低為對(duì)照的0.49倍，隨后表達(dá)量上調(diào)，在 12h時(shí)達(dá)到最高水平是對(duì)照的3.67倍（圖6-C）。

圖6 利用qRT-PCR檢測(cè)不同激素處理對(duì)苜蓿莖MsNST表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of various treatments on MsNST expression in alfalfa stems using qRT-PCR

2.3 擬南芥中過(guò)表達(dá)MsNST的功能分析

為驗(yàn)證MsNST的功能，通過(guò) kan抗性篩選與PCR鑒定過(guò)表達(dá)MsNST擬南芥陽(yáng)性株系（圖7-B）。隨機(jī)挑選 6個(gè)過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比株高出現(xiàn)不同程度的矮化（圖 7-A），其中35S::MsNST-Line4中MsNST表達(dá)量最高，是對(duì)照的3.47倍(圖 7-C)。觀測(cè)Line4和WT植株下胚軸的生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，光照條件下35S::MsNST-Line4與 WT的下胚軸長(zhǎng)度變化不明顯；黑暗條件下，35S::MsNST-Line4下胚軸生長(zhǎng)受到抑制，萌發(fā) 5天時(shí)35S::MsNST-Line4下胚軸長(zhǎng)度為9.02 mm，顯著短于對(duì)照組（11.39mm）（圖7-D）。對(duì)生長(zhǎng)7周齡的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥株高等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，轉(zhuǎn)基因擬南芥株高平均值為27.62cm，與對(duì)照相比株高降低了 10.4%；轉(zhuǎn)基因擬南芥鮮重降低（1.12g），比對(duì)照降低了20%（圖7-E）。

2.4 過(guò)表達(dá)MsNST對(duì)木質(zhì)素、纖維素及總糖含量的影響

通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)擬南芥35S::MsNST-Line4和WT植株從下數(shù)第一節(jié)莖段橫切，利用間苯三酚-鹽酸對(duì)細(xì)胞壁中木質(zhì)素染色，顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)35S::MsNST-Line4的束間纖維（interfascicular fiber，IF）細(xì)胞壁厚度增加（圖8-A），統(tǒng)計(jì)分析表明Line4束間纖維細(xì)胞壁平均厚度為 1.58μm，WT細(xì)胞壁厚度為 0.92μm，與WT相比過(guò)表達(dá)MsNST纖維細(xì)胞壁厚度增加了71.7%（圖8-B），暗示MsNST對(duì)束間纖維細(xì)胞壁的合成具有一定調(diào)節(jié)作用。對(duì)過(guò)表達(dá) Line4株系的木質(zhì)素和纖維素含量測(cè)定表明，轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞壁木質(zhì)素含量相比WT提高了11.7%（圖8-C）；Line4株系結(jié)晶纖維素含量為 239.15 mg·g-1，是 WT的 1.13倍（圖8-D）；總糖含量為355.55mg·g-1，比WT提高了7%（圖8-E）。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定與表型分析Fig. 7 Identification and phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana

圖8 過(guò)表達(dá)MsNST對(duì)細(xì)胞壁厚度及木質(zhì)素、纖維素和總糖含量的影響Fig. 8 Effects of overexpression MsNST on cell wall thickness, lignin, cellulose and total sugar content in transgenic Arabidopsis thaliana

2.5 過(guò)表達(dá) MsNST擬南芥中纖維素和木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

為了揭示MsNST對(duì)次生壁纖維素和木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的調(diào)控作用，利用qRT-PCR檢測(cè)Line4株系中次生壁纖維素合成關(guān)鍵基因AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8和木質(zhì)素合成相關(guān)基因AtPAL1、At4CL1和AtCOMT的表達(dá)量水平，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)MsNST提高了次生壁纖維素合酶亞基基因AtCesA4，7，8的表達(dá)水平，其中AtCesA7表達(dá)量上調(diào)最為明顯，是野生型的2.81倍；木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因AtPAL1, At4CL1和AtCOMT的表達(dá)水平也提高，分別是對(duì)照的1.64倍，1.77倍和2.28倍（圖9）。

2.6 過(guò)表達(dá) MsNST紫花苜蓿的鑒定與木質(zhì)素和纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

經(jīng)抗性篩選獲得抗kan的紫花苜蓿株系，經(jīng)鑒定獲得的4株過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，其中OE1表達(dá)量最高，是對(duì)照的2.7倍（圖10-A, B）。生長(zhǎng)1個(gè)月的OE1植株高度為23.45cm，低于對(duì)照組26.32cm（圖10-C）。從頂端往下測(cè)定6個(gè)節(jié)間長(zhǎng)度的結(jié)果表明，從第二個(gè)節(jié)間開(kāi)始明顯短于對(duì)照組（圖 10-D）。qRT-PCR分別檢測(cè)各轉(zhuǎn)基因株系中MsNST的表達(dá)量，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)株系OE1中MsNST表達(dá)量顯著上調(diào)，是對(duì)照組的2.74倍。對(duì)纖維素與木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)分析表明，纖維素合成關(guān)鍵基因MsCesA6和MsCesA7表達(dá)量上調(diào)表達(dá)，分別為對(duì)照的1.45倍和1.43倍（圖10-E）。木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因MsPAL、Ms4CL和MsCOMT也得到不同程度上調(diào)，其中MsPAL表達(dá)量最大，是對(duì)照的1.5倍（圖10-E）。

圖9 過(guò)表達(dá)MsNST基因擬南芥中纖維素與木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig. 9 Expression analysis of genes related to cellulose and lignin synthesis in overexpression MsNST transgenic Arabidopsis thaliana

圖10 過(guò)表達(dá)MsNST紫花苜蓿的獲取及其木質(zhì)素和纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig. 10 Identification of transgenic alfalfa and analysis of genes related to cellulose and lignin synthesis of transgenic lines

3 討論

NAC家族的NST轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物次生壁物質(zhì)合成[3-5,7,9,25]。OOKA在分析擬南芥和水稻 NAC轉(zhuǎn)錄因子的保守性時(shí)，發(fā)現(xiàn) N端含有A、B、C、D、E 5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域[24]。本研究將MsNST氨基酸序列與擬南芥3個(gè)同源基因進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果表明在N端也具有5個(gè)典型的NAC保守結(jié)構(gòu)域，與Ooka的分析結(jié)果一致；然而MsNST氨基酸序列的C端不保守，可能是導(dǎo)致該基因的功能具有多樣性的主要原因（圖 3）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，不同植物的NST分為單子葉和雙子葉兩個(gè)分枝，暗示不同物種之間存在一定程度的進(jìn)化；但是MsNST與豆科模式植物蒺藜苜蓿NST1的同源性最近，表明其可能與MtNST1具有相似的功能。前人研究表明NAC類轉(zhuǎn)錄因子大都通過(guò)兩個(gè)反向平行的β折疊片和2個(gè)鹽橋作用形成同源或異源二聚體，起到轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用，其中N端保守的精氨酸（R）和谷氨酸（E）位點(diǎn)對(duì)鹽橋形成起到關(guān)鍵作用[26]。對(duì)MsNST蛋白序列分析表明，N端保守序列中具有參與鹽橋形成的精氨酸和谷氨酸保守位點(diǎn)，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也表明其能夠通過(guò)兩個(gè)β折疊形成同源二聚體結(jié)構(gòu)，表明MsNST很可能通過(guò)形成同源二聚體結(jié)構(gòu)對(duì)靶基因起作用。

GA是植物內(nèi)源激素，在植物次生壁發(fā)育中起到重要作用。研究表明，煙草內(nèi)源GA3含量增加會(huì)提高莖的木質(zhì)化程度[27]。擬南芥和白樺外源施加 GA也顯著增加莖中木質(zhì)部的面積占比[28-29]。此外，水稻OsSLR1是一種受GA信號(hào)誘導(dǎo)裂解的DELLA阻遏蛋白，可以直接與 OsNAC相互作用，抑制NAC-MYB級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控次生壁合成基因表達(dá)[13]。以上研究結(jié)果與本研究中GA3誘導(dǎo)MsNST表達(dá)水平升高相符合（圖5-A），表明在紫花苜蓿中GA3具有激活MsNST表達(dá)的作用。生產(chǎn)中常用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑多效唑（PCB）降低頂端優(yōu)勢(shì)，增加壁厚，提高植株耐逆性。施加PCB能夠顯著提高莖稈中PAL和 CAD等酶活性，增加植物次生壁厚度，促進(jìn)莖稈木質(zhì)素積累，增強(qiáng)植物莖稈的抗倒伏能力[17,30-31]。研究表明PCB抑制植物體內(nèi)GA的生物合成[32]，本研究施加PCB短期內(nèi)（0—4h），MsNST表達(dá)量受到PCB影響而降低，可能是 PCB抑制了植物體內(nèi)的GA合成，降低MsNST表達(dá)。PCB處理 4—8h時(shí)MsNST表達(dá)量顯著提高，這與施加PCB能夠提高植株莖中細(xì)胞壁厚度與積累木質(zhì)素相符合。然而，PCB導(dǎo)致次生壁NST類轉(zhuǎn)錄因子激活的分子調(diào)控機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道，筆者猜想PCB可能還存在其他途徑直接或間接影響MsNST表達(dá)，具體分子調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。SA是植物響應(yīng)生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)激素，由苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）催化合成的肉桂酸鹽經(jīng)苯甲酸鹽合成[33]。外施SA 12h提高了MsNST的表達(dá)水平，表明 SA能夠通過(guò)誘導(dǎo)MsNST表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞壁積累木質(zhì)素和纖維素，增加植物對(duì)病原菌的抵抗能力[15,34-35]，但是SA誘導(dǎo)初期MsNST表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào)的現(xiàn)象還沒(méi)有明確的研究結(jié)果。

擬南芥、玉米和楊樹(shù)等植物中，過(guò)表達(dá)NST會(huì)造成纖維細(xì)胞次生壁增厚，細(xì)胞壁中纖維素與木質(zhì)素含量顯著增加[5,9,25,36]。此外，擬南芥nst1nst3和截形苜蓿mtnst1突變體中，由于NST的突變，造成植物莖纖維細(xì)胞次生壁缺失，木質(zhì)素與纖維素含量顯著降低[4-5,37]。本研究在擬南芥與紫花苜蓿過(guò)表達(dá)MsNST，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株矮化，各節(jié)間高度受到抑制。此外，擬南芥花序莖束間纖維細(xì)胞壁增厚，細(xì)胞壁結(jié)晶纖維素與木質(zhì)素含量顯著增加，表明MsNST與其它植物中NST轉(zhuǎn)錄因子的功能相似，在調(diào)控纖維素與木質(zhì)素生物合成過(guò)程中起到重要作用。筆者還發(fā)現(xiàn)MsNST影響黑暗條件下擬南芥下胚軸發(fā)育，暗示MsNST可能在擬南芥下胚軸發(fā)育時(shí)參與細(xì)胞壁物質(zhì)合成。研究表明，許多纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因表達(dá)受到NST的影響，從而影響次生壁纖維素與木質(zhì)素合成，例如AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8是組裝擬南芥次生壁CSC必須的亞基，對(duì)植物次生壁纖維素合成起到關(guān)鍵作用[38-41]。研究表明，擬南芥MYB46及其同源基因MYB83是SND1/NST3轉(zhuǎn)錄因子的直接靶基因，MYB46通過(guò)反應(yīng)順式調(diào)控元件（SMRE）直接結(jié)合CesAs的啟動(dòng)子，形成保守的 NACs-MYBs-CesAs纖維素合成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[42]。木質(zhì)素合成調(diào)控機(jī)制還未明確，但是擬南芥PAL1、4CL1、COMT等木質(zhì)素合成過(guò)程中重要酶基因表達(dá)都受到 NST轉(zhuǎn)錄因子的影響[3-5]。豆科模式植物蒺藜苜蓿與單子葉玉米中NST突變導(dǎo)致纖維素和木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因表達(dá)量下調(diào)[9,37]。本研究對(duì)過(guò)表達(dá)MsNST擬南芥和紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因株系的纖維素與木質(zhì)素合成基因定量分析表明，MsNST對(duì)纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)纖維素與木質(zhì)素合成。本研究初步揭示了紫花苜蓿MsNST轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞壁纖維素和木質(zhì)素合成中的正調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究克隆了紫花苜蓿木質(zhì)素和纖維素合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因（MsNST），該基因在細(xì)胞壁木質(zhì)素和纖維素合成中起到正向調(diào)控作用，激活下游基因表達(dá)。MsNST基因隸屬NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，并具有該家族的特有的 NAC保守結(jié)構(gòu)域。MsNST受到外源激素GA3、PCB和SA誘導(dǎo)表達(dá)。