原新博，程婷婷，惠小涵，陳章玉，王瑞紅，柯衛(wèi)東，郭宏波

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院/中藥指紋圖譜國家地方聯(lián)合工程研究中心/陜西省中藥指紋圖譜與天然產(chǎn)物庫研究中心，陜西楊凌 712100；2西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；3武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，武漢430065）

0 引言

【研究意義】蓮藕（Nelumbo nuciferaGaertn.）是我國最大的水生蔬菜種類[1]，藥食兩用，其整個(gè)植株10個(gè)部位中有6個(gè)部位入藥，具有降脂減肥、抗氧化、抗衰老、安神助眠等藥理學(xué)功效。蓮藕具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用功效[2]，但采后褐變嚴(yán)重影響了其商品性及加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為解決蓮藕采后貯藏和加工過程中由多酚氧化酶（PPO）引起的褐變問題，研究篩選、驗(yàn)證PPO與何蛋白互作，逐步摸清其在蓮藕中的作用機(jī)制，對于采后控制蓮藕褐變，延長其產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PPO是由核基因編碼的一種含銅金屬酶[3]，可將其分為單酚氧化酶（酪氨酸氧化酶）、雙酚氧化酶（兒茶酚氧化酶）和漆酶 3類[4]，在動(dòng)植物、真菌和昆蟲的質(zhì)體中廣泛存在[5-6]。PPO通常由3部分組成：一個(gè)N端導(dǎo)肽區(qū)，一個(gè)高度保守的CuA和CuB區(qū)以及一個(gè)C端疏水區(qū)域[7]；PPO的主要功能區(qū)是Cu結(jié)合區(qū)，其他部分對酶空間構(gòu)象、高級結(jié)構(gòu)形成和維持起作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)PPO在植物中有多種重要功能，如抗病蟲害、抗機(jī)械損傷、參與花色的形成、參與光合作用、酶促褐變等[9-13]。在植物細(xì)胞中，PPO和多酚是相互獨(dú)立的兩類物質(zhì)，前者主要分布于類囊體中，后者存在于液泡中，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，PPO會(huì)在氧氣的參與下，催化多酚類物質(zhì)生產(chǎn)醌類黑色素，使蓮藕等果蔬褐變[7,14]。草酸處理蓮藕切片可延緩切面褐變，并且顯著降低PPO的活性[15]?？箟难岷吞J薈凝膠聯(lián)合使用抑制貯藏期間蓮藕表面褐變，并抑制過氧化物酶（POD）和PPO的活性[16]。通過人工microRNAs基因沉默技術(shù)，同時(shí)下調(diào)馬鈴薯多酚氧化酶基因家族中StuPPO2、StuPPO3和StuPPO4，會(huì)產(chǎn)生低活性的PPO和低褐變的馬鈴薯[17]。洋蔥提取物中的低分子量化合物對芋頭多酚氧化酶和酶促褐變具有抑制作用[18]。番木瓜粗提物中存在的低分子量熱穩(wěn)定陰離子化合物可與 PPO催化活性雙核位點(diǎn)結(jié)合，抑制PPO的活性[19]。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將反義PPO轉(zhuǎn)入蘋果愈傷組織中，PPO活性和愈傷組織的褐變潛力均發(fā)生變化[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于PPO導(dǎo)致蓮藕等果蔬褐變的分子機(jī)制未見報(bào)道，僅有關(guān)于酶學(xué)性質(zhì)、體外抑制PPO活性、生理活性等的研究。有研究表明SOD、CAT和POD等抗氧化酶也參與了蓮藕的褐變過程[21]。筆者課題組前期發(fā)現(xiàn)NnPPO1與多個(gè)蛋白存在互作[22]，本研究進(jìn)一步篩選、驗(yàn)證與蓮藕NnPPO1互作的褐變相關(guān)酶?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用Y2H技術(shù)，從抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)中篩選出NnCAT1與NnPPO1存在蛋白互作；利用BiFC技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證NnPPO1與NnCAT1之間是否存在互作，通過截短蛋白尋找互作關(guān)鍵位點(diǎn)；并對NnPPO1與NnCAT1進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析；對NnCAT1進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位分析。為深入研究蓮藕中NnPPO1與NnCAT1互作的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為精準(zhǔn)控制NnPPO1酶活性、降低褐變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)材料為蓮藕‘鄂蓮5號’品種；煙草為本氏煙草（Nicotiana benthamiana），種子播種于營養(yǎng)土中，萌發(fā)后7 d左右開始澆營養(yǎng)液，每隔2 d澆一次，溫室溫度為25℃，濕度約為70%，光照周期為14 h光照、10 h黑暗。

1.1.2 試驗(yàn)試劑及載體 植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程有限公司；熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；大腸桿菌感受態(tài)、酵母菌感受態(tài)、農(nóng)桿菌感受態(tài)、同源重組試劑盒Quick-Clone Mix購自陜西普因特生物公司；DNA marker、DNA膠回收純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA公司；X-α-Gal、Aureobasidin A購自Clontech公司；PCR引物合成及載體測序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

構(gòu)建所有載體使用的大腸桿菌是EPI300感受態(tài)，酵母雙雜試驗(yàn)所用載體為pGADT7和pGBKT7，酵母菌株為Y2HGold感受態(tài)，亞細(xì)胞定位試驗(yàn)使用的載體是p35S-eGFP[23]，雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)所使用的載體是35S-SPYNER173與35S-SPYCEM[24]。注射煙草葉片所使用的農(nóng)桿菌菌株是GV3101感受態(tài)。

1.2 RNA提取及基因克隆

使用Plant RNA Extraction Kit（Takara）提取蓮藕葉片總RNA；利用PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以蓮藕葉片cDNA為模板，利用基因特異性引物（表1）對抗壞血酸過氧化物酶（APX）（GenBank: GU174022）[25]、過氧化氫酶（NnCAT1）、胞質(zhì)銅-鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）（GenBank: GQ149102）[26]、半胱氨酸過氧化物酶（PER1）（GenBank: KU923323）[27]、過氧化物酶3（POD3L）（GenBank: XM_010245037）、過氧化物酶 43（POD43L）（GenBank: XM_010247537）、過氧化物酶 P7（PODP7L）（GenBank: XM_010248161）等5種抗氧化酶的7個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系為 25 μL：cDNA 1 μL、PrimeSTAR Max Premix（2×）12.5 μL、上下游引物各 1 μL 和 ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 10 s；60℃ 15 s，72℃ 2 min，34個(gè)循環(huán)，16℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用膠回收試劑盒純化，得到目的片段。

1.3 共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證

按照同源重組Quick-Clone Mix試劑盒的操作步驟，將APX、NnCAT1、CuZnSOD、PER1、POD3L、PODP7L、POD43L等的編碼區(qū)分別克隆到 pGADT7（AD）載體上，課題組前期構(gòu)建多酚氧化酶誘餌載體NnPPO1-BD和去除N端導(dǎo)肽部分的誘餌載體JDPPO1-BD[22]；通過PEG/LiAc介導(dǎo)的方法，將質(zhì)粒組合APX-AD+JDPPO1-BD、NnCAT1-AD+JDPPO1-BD、CuZnSOD-AD+JDPPO1-BD、PER1-AD+JDPPO1-BD、POD3L-AD+JDPPO1-BD、POD43L-AD+JDPPO1-BD、PODP7L-AD+JDPPO1-BD、pGBKT7-53+pGADT7-T（陽性對照）和pGBKT7-Lam+pGADT7-T（陰性對照）分別轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂于DDO（SD/-Trp/-Leu）二缺平板上，進(jìn)行篩選含質(zhì)粒的酵母，28℃培養(yǎng)3—5 d。從DDO平板上挑取直徑為2—3 mm的陽性克隆于DDO液體培養(yǎng)基中，在30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)過夜（12—16 h）。吸取1.5 μL酵母菌液均勻點(diǎn)播于提前標(biāo)記好的QDO（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）/X-α-Gal/AbA 和 DDO（SD/-His/-Ade）培養(yǎng)基上，28—30℃生長3—5 d后，分析菌落的生長狀況。

1.4 互作蛋白的毒性和自激活檢測

前期已做過NnPPO1的毒性與自激活檢測[22]，利用基因特異性引物將NnCAT1的編碼區(qū)克隆至pGBKT7（BD）載體上，將重組載體NnCAT1-BD和

空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂于SD/-Trp培養(yǎng)基上篩選，挑取單克隆，稀釋100倍分別涂布在SD/-Trp培養(yǎng)基上。將質(zhì)粒組合 NnCAT1-BD+AD、pGBKT7-53+pGADT7-T（陽性對照）、pGBKT7-53+pGADT7-Lam（陰性對照）分別轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂于DDO（SD/-Trp/-Leu）二缺平板上，挑菌后均勻點(diǎn)播于SD/-Trp和SD/-Trp/-Leu/-His培養(yǎng)基上，28—30℃生長3—5 d后，分析菌落的生長狀況。

表1 PCR 引物列表Table 1 PCR primer list

1.5 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證互作蛋白

利用同源重組技術(shù)，選擇BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)，將NnPPO1和NnCAT1的編碼區(qū)分別構(gòu)建至35S-SPYNER173和35S-SPYCEM載體上，通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，28℃生長2 d后挑取陽性菌落于YEB液體培養(yǎng)基（含20 μg·mL-1Rif和50 μg·mL-1Kana）中，28℃振蕩培養(yǎng) 12—16 h。離心收集菌體，用煙草注射滲透液（10 mmol·L-1MES-KOH（pH 5.6）、10 mmol·L-1MgCl2和 150 μmol·L-1乙酰丁香酮）重懸菌體至 OD600=0.8，將含有 35S-NnPPO1-SPYNER173、35S-NnCAT1-SPYCEM、P19和 35SNnPPO1-SPYNER173、35S-SPYCEM、P19的菌液分別按照1∶1∶1混合后黑暗靜止4 h，然后注射到生長約35 d的煙草葉片中。2—5 d內(nèi)，使用生物激光共聚焦顯微鏡（LECIA TCSSP8）觀察表皮細(xì)胞的黃色熒光信號。

經(jīng)濟(jì)發(fā)展形勢好，但國防觀念不牢固。經(jīng)濟(jì)功能區(qū)是各地經(jīng)濟(jì)發(fā)展的火車頭，總體發(fā)展形勢比較好，但專注考慮經(jīng)濟(jì)發(fā)展多，對包括武裝工作在內(nèi)的其他工作大多重視不夠。有的黨政機(jī)關(guān)對民兵工作認(rèn)識不全面不深入，一些企業(yè)認(rèn)為編民兵會(huì)影響生產(chǎn)經(jīng)營，有的甚至害怕與軍方有關(guān)聯(lián)影響對外貿(mào)易；同時(shí)受長期和平環(huán)境影響，全民國防意識有所淡化，企業(yè)員工對加入民兵組織積極性不高，民兵訓(xùn)練難落實(shí)的問題在經(jīng)濟(jì)功能區(qū)也更為突出。

1.6 蛋白序列分析和互作結(jié)構(gòu)域分析

通過兩種方法證實(shí)NnPPO1和NnCAT1之間是否存在互作及兩者間如何互作，對NnPPO1和NnCAT1序列進(jìn)行分析，用NCBI的Conserved Domains服務(wù)器分析NnPPO1和NnCAT1蛋白氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；使用DNAMAN軟件對NnCAT1與其他物種CAT序列進(jìn)行多序列比對；根據(jù)NnPPO1和NnCAT1的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果，將 NnCAT1的主要結(jié)構(gòu)域 Catalase Domain（16—398 aa）和 Heme-binding Enzyme Domain（16—493 aa）分別構(gòu)建到 AD載體上，將 NnPPO1的主要結(jié)構(gòu)域 Tyrosinase Domain（175—380 aa）、PPO1_KFDV Domain（381—468 aa）和 PPO1_DWL Domain（469—597 aa）分別構(gòu)建到BD載體上，利用酵母雙雜的技術(shù)分析互作關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。

1.7 亞細(xì)胞定位分析

設(shè)計(jì)引物（表1），使用PrimeSTAR擴(kuò)增出NnCAT1的編碼區(qū)，選擇BamH I和KpnI酶切位點(diǎn)，然后構(gòu)建到p35S-eGFP載體上，與GFP蛋白融合表達(dá)。通過農(nóng)桿菌注射本氏煙草。2—5 d，在生物激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光以及紅色熒光信號。

1.8 NnPPO1與NnCAT1的組織特異性表達(dá)

啟動(dòng)子不僅調(diào)控著基因的表達(dá)水平，也調(diào)控著基因表達(dá)的時(shí)空順序。用 PlantCARE對NnPPO1和NnCAT1的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析；然后對它們的組織特異性表達(dá)進(jìn)行分析，先將鄂蓮5號的蓮子在試驗(yàn)室發(fā)芽，待芽長至約10 cm時(shí)，選取大小基本一致的蓮藕幼苗，種植于塑料桶中，桶內(nèi)裝土高度約10 cm，桶內(nèi)裝滿水。待蓮藕葉片完全展開，并長出藕帶時(shí)，采收葉、葉柄、根、藕帶、莖尖等部位，用液氮速凍，放于-80℃冰箱儲(chǔ)存。使用RNA提取試劑盒提取樣品總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，蓮藕β-actin為內(nèi)部參照基因[28]，在QuantStudio（TM）6 Flex System實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各 0.8 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，稀釋5倍的cDNA 2 μL，以ddH2O補(bǔ)足至20 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，30 s；95℃，10 s，60℃，30 s，72℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，4 min。并通過SPSS的t檢驗(yàn)確定顯著性（P≤0.05）[29]。各部位樣品均設(shè)3個(gè)技術(shù)性和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.9 NnCAT1的生物信息學(xué)分析

為進(jìn)一步探討NnCAT1的生物學(xué)功能及其在蓮藕褐變中的作用機(jī)制，本研究使用 Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）對 NnCAT1蛋白（XP_010242894）的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用 TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對NnCAT1的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 4.1/）對 NnCAT1的信號肽進(jìn)行預(yù)測；利用 ChloroP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）對NnCAT1的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行預(yù)測；利用 Expasy（https://web.expasy.org/protscale/、https://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蓮藕NnCAT1的親疏水性分析；為了研究NnCAT1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，分別用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）[30]預(yù)測 NnCAT1二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 酵母雙雜交篩選NnPPO1的互作蛋白

以蓮藕cDNA為模板擴(kuò)增7個(gè)基因（APX、CuZnSOD、PER1、POD3L、POD43L、PODP7L和NnCAT1）的編碼區(qū)，分別得到1 044、459、660、981、963、957和1 479 bp的條帶（圖1-A）。將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至EPI300大腸桿菌后，進(jìn)行菌落PCR檢測分析，得到的條帶與預(yù)期的目的片段大小相同，將陽性菌液測序比對成功后，進(jìn)行Y2H配對分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酵母菌在 DDO平板上生長良好，只有含NnCAT1-AD+JDPPO1-BD的酵母菌和陽性對照能在QDO/X/A平板上生長（圖 1-B），表明 JDPPO1與NnCAT1之間可能存在蛋白互作。

2.2 互作蛋白的毒性和自激活檢測

本研究對NnCAT1進(jìn)行自激活和毒性檢測。將含有NnCAT1-pGBKT7和對照組空載體pGBKT7的酵母，稀釋相同倍數(shù)后分別涂布在 SD/-Trp平板上，結(jié)果顯示，兩個(gè)平板上的菌落大小和數(shù)目基本相同（圖2-A），表明重組載體表達(dá)的NnCAT1蛋白對酵母的生長沒有影響，對酵母菌無毒性。將含有NnCAT1-pGBKT7、陽性對照和陰性對照的酵母菌，稀釋相同倍數(shù)后分別涂布在一缺 SD/-Trp和三缺SD/-Trp/-Ade/-His平板上，只有陽性對照在一缺和三缺平板上正常生長，含NnCAT1-pGBKT7載體的酵母菌和陰性對照在三缺平板上不能生長（圖 2-B），說明 NnCAT1無自激活作用，無法將報(bào)告基因激活，JDPPO1與NnCAT1在酵母系統(tǒng)中確實(shí)存在互作。

圖1 基因的克隆及互作蛋白篩選Fig. 1 Gene cloning and screening of interacting proteins

圖2 蓮藕NnCAT1蛋白的毒性和自激活檢測Fig. 2 Detection of Toxicity and self-activation of NnCAT1 Protein

2.3 雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證蛋白互作的真實(shí)性

35S-NnPPO1-SPYNER173與35S-NnCAT1-SPYCEM的組合有很強(qiáng)的黃色熒光信號，并且黃色熒光主要集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，而35S-NnPPO1-SPYNER173與空載體 35S-SPYCEM 的組合中未觀察到黃色熒光信號（圖3），說明在BiFC系統(tǒng)中NnPPO1與NnCAT1存在蛋白互作，并且互作位置在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，也進(jìn)一步證實(shí)了酵母雙雜交結(jié)果。

圖3 雙分子熒光互補(bǔ)檢測NnPPO1與NnCAT1互作Fig. 3 Interaction between NnPPO1 and NnCAT1 detected by bimolecular fluorescence complementarity

2.4 蛋白序列分析和互作結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN軟件將NnCAT1與其他物種CAT氨基酸序列進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白C末端包含保守的三肽模體（QKL）（圖4），該模體可以與PTS1受體結(jié)合，說明蓮藕NnCAT1可能是通過PTS1系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶體。NnCAT1氨基酸序列與冬棗ZjCAT的相似度最高，達(dá)到91.67%，其次是與油菜、擬南芥、玉米、高粱的相似度分別為87.40%、86.79%、86.18%和86.18%，與大麥、木薯的相似度分別為83.94%和80.49%；證明該序列為蓮藕的CAT，故命名為 NnCAT1。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，NnPPO1主要有 Tyrosinase Domain（175—380 aa）、PPO1_DWL Domain（381—468 aa）和 PPO1_KFDV Domain（469—597 aa）等3個(gè)結(jié)構(gòu)域；NnCAT1主要有Catalase Domain（16—398 aa）和Heme-binding Enzyme Domain（16—493 aa）結(jié)構(gòu)域。將NnPPO1和NnCAT1的主要結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建到BD和AD載體上，BD-NnPPO1175-380、BD-NnPPO1381-468、BD-NnPPO1469-597分別與AD-NnCAT1互作的結(jié)果顯示，只有BD- NnPPO1175-380與AD-NnCAT1發(fā)生蛋白互作（圖5），說明NnPPO1與NnCAT1的互作關(guān)鍵部位在其保守的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域（Tyrosinase domain）；而 AD-NnCAT116-398、AD-NnCAT116-493與BD-JDPPO1均不發(fā)生蛋白互作，在酵母系統(tǒng)中NnCAT1必須具有完整的氨基酸序列才可以與JDPPO1的互作。

圖4 蓮藕NnCAT1與其他物種CAT蛋白的氨基酸序列比對Fig. 4 Amino acid sequence alignment of NnCAT1 with other CAT proteins

圖5 酵母雙雜交驗(yàn)證互作關(guān)系Fig. 5 Results of the yeast two-hybrid

2.5 NnCAT1的亞細(xì)胞定位

將NnCAT1編碼區(qū)構(gòu)建至p35S-eGFP載體上，與載體中的eGFP蛋白融合表達(dá)，將重組質(zhì)粒與空載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，通過在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá) NnCAT1與 GFP的融合蛋白，發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號存在于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，并且與膜核定位信號（mCherry）紅色熒光重合，空載體 GFP顯示了相同的定位情況（圖6）。

圖6 NnCAT1蛋白的亞細(xì)胞定位分析Fig. 6 Subcellular localization analysis of NnCAT1 protein

2.6 NnPPO1與NnCAT1的組織特異性表達(dá)

利用PlantCARE對NnPPO1和NnCAT1起始密碼子上游約2 000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，NnPPO1序列中含有 AAAC-motif、Box 4、GT1-motif、TCCC-motif、TCT-motif、chs-CMA1a等光響應(yīng)元件，ARE逆境響應(yīng)元件，以及 CGTCA-motif、TGACG-motif、P-box等激素響應(yīng)元件，推測NnPPO1的表達(dá)可能受到上述各因素的調(diào)控。NnCAT1序列中含有ATCT-motif、Box 4、G-box、GATA-motif、GT1-motif、I-box、TCT-motif等光響應(yīng)性元件，ARE、MBS、TC-rich repeats等逆境響應(yīng)元件，以及ABRE、CGTCA-motif、TCA-element、TGACG-motif等激素響應(yīng)元件，推測NnCAT1的表達(dá)可能受到上述各因素的調(diào)控，部分響應(yīng)元件見表2。

表2 NnPPO1與NnCAT1啟動(dòng)子響應(yīng)元件Table 2 The response elements of NnPPO1 and NnCAT1

在蓮藕幼苗的不同組織中兩個(gè)基因均有表達(dá)。以葉中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，NnPPO1在葉中表達(dá)水平最高，根中其次，在莖尖中最低，并且NnPPO1在葉中的表達(dá)量是莖尖中的 15.19倍；NnCAT1在葉中表達(dá)水平最高，然后依次是葉柄、根、藕帶，在莖尖中的表達(dá)量最低。另外，NnPPO1與NnCAT1的表達(dá)模式基本相同，都在葉中有最高的表達(dá)量，在莖尖中表達(dá)量最低。方差分析結(jié)果表明，5個(gè)部位中的NnPPO1表達(dá)量均有顯著差異；根中NnCAT1的表達(dá)量與藕帶中的差異不顯著，其余部位之間均差異顯著（圖7）。由此推測NnPPO1與NnCAT1可能在葉、葉柄和根的顏色與生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

2.7 NnCAT1的生物信息學(xué)分析

蓮藕NnCAT1的相對分子質(zhì)量約為57.0 kD，理論等電點(diǎn)（PI）為6.93。正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為60個(gè)，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為62個(gè)，其分子式可寫為 C2573H3874N716O727S17，不穩(wěn)定系數(shù)為33.03，屬于穩(wěn)定蛋白；跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測結(jié)果顯示NnCAT1無跨膜區(qū)、無信號肽；葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測結(jié)果表明，NnCAT1存在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，前21 aa為轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域。NnCAT1的親疏水性分析，結(jié)果如圖8所示，分值在0以上為疏水性氨基酸，在0以下為親水性氨基酸，得分最大值為2.389，最小值為-2.678，平均值為-0.587，證明NnCAT1是親水性蛋白質(zhì)。

圖7 NnPPO1與NnCAT1的組織特異性表達(dá)Fig. 7 Tissue-specific expression of NnPPO1 and NnCAT1

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，NnCAT1蛋白由27.64%α-螺旋、15.65%延長鏈、6.30%β-轉(zhuǎn)角和50.41%無規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖9-A）。NnCAT1的三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，其序列的一致性為47.64%，為同源四聚體蛋白，序列與模板序列的相似度為0.43，覆蓋為0.99，為Catalase-like Superfamily家族CATALASE蛋白，與目標(biāo)基因相吻合（圖9-B）。

圖8 NnCAT1蛋白親疏水性分析Fig. 8 Hydrophilicity of NnCAT1 Protein

圖9 NnCAT1的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 9 Secondary structure and tertiary structure prediction of NnCAT1

3 討論

3.1 NnPPO1與NnCAT1存在蛋白互作

蛋白互作是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，但關(guān)于PPO的蛋白互作，除本課題組研究結(jié)果外，未見其他文獻(xiàn)報(bào)道。張海星[31]通過酵母雙雜和BIFC證實(shí)了丹參PPO和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶存在互作關(guān)系，證明丹參PPO對丹酚酸類的代謝有一定的調(diào)控作用。擬南芥 AtNCA1與AtCAT2相互作用，可以將過氧化氫酶的折疊保持在功能狀態(tài)，AtNCA1對于過氧化氫酶活性至關(guān)重要[32]。水稻葉片中GLO和OsCAT的互作-解離是調(diào)節(jié)水稻中H2O2水平的一種特定機(jī)制[33]。

SOD和CAT酶活性是蓮藕褐變的第二主因子，所以在研究蓮藕褐變機(jī)理時(shí)，可以從SOD和CAT方面著手[21]。為了深入探索PPO導(dǎo)致蓮藕等果蔬褐變的分子機(jī)制，本研究利用蓮藕NnPPO1成員，通過酵母雙雜方法，從抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)中篩選出NnCAT1蛋白與NnPPO1互作，NnCAT1具有CAT蛋白家族的所有主要特征氨基酸殘基、基序和元件[34]，主要功能是催化過氧化氫分解為H2O和 O2，以防止活性氧自由基對植物造成的傷害[35]。同時(shí)過氧化氫酶在植物中有很多作用，如抗高（低）溫脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫、抗病性、延緩植物衰老等[36-41]。本研究在煙草葉片細(xì)胞膜和細(xì)胞核上檢測到強(qiáng)烈的黃色熒光信號，更加確定了NnPPO1與NnCAT1之間存在相互作用關(guān)系。推測 NnPPO1與 NnCAT1協(xié)同互作導(dǎo)致果蔬褐變，NnCAT1將H2O2分解產(chǎn)生的O2進(jìn)入質(zhì)體中，此時(shí)在NnPPO1的強(qiáng)烈催化下，產(chǎn)生的O2直接與多酚類物質(zhì)反應(yīng)形成醌類，這時(shí)果肉逐漸變色，具體還需要蛋白水平和遺傳水平的進(jìn)一步驗(yàn)證。

多序列比對發(fā)現(xiàn)NnCAT1與其他物種的CAT具有很高的相似度，表明不同物種間CAT序列具有很強(qiáng)的保守性；NnPPO1與NnCAT1的互作關(guān)鍵部位在其保守的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域，而此結(jié)構(gòu)域包含CuA和CuB的活性中心，互作結(jié)果與前人所述的 Tyrosinase Domain是NnPPO1主要功能區(qū)一致[8]；NnCAT1的完整氨基酸序列才能與JDPPO1發(fā)生互作，說明除結(jié)構(gòu)域以外的部分對NnCAT1的互作過程中有不可或缺的作用，為進(jìn)一步研究互作機(jī)理及構(gòu)建cat1、ppo1突變體植株提供了參考。

3.2 亞細(xì)胞定位與組織表達(dá)特異性分析

本研究結(jié)果表明，NnCAT1定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核，而前期研究表明NnPPO1存在于葉綠體上[22]，結(jié)合它們的互作位置在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，說明正常狀態(tài)時(shí)NnCAT1與NnPPO1并不接觸，推測在蓮藕組織或細(xì)胞受到損傷，這種空間隔離打破后，它們會(huì)到共同的位置上協(xié)同作用導(dǎo)致蓮藕褐變。研究表明 CAT定位于過氧化物酶體中，但也有分布于其他部位，玉米的CAT3定位于線粒體中，它可能在替代氧化酶途徑中起作用[42]。擬南芥 AtCAT3亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，AtCAT3定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、過氧化物酶體中，說明AtCAT3也參與了細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中H2O2的代謝[43]。檳榔過氧化氫酶（ArCAT）亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，ArCAT1蛋白定位于過氧化物酶體中，而ArCAT2和 ArCAT3定位于過氧化物酶體和細(xì)胞核中[44]。紅莧菜過氧化氫酶-酚氧化酶（AcCATPO）位于過氧化物酶體和細(xì)胞核中[45]。CAT的定位與其在細(xì)胞中的功能有著密切的關(guān)系。

NnPPO1啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了很多光響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)和激素響應(yīng)元件，NnCAT1啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了很多光響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)、激素響應(yīng)、干旱響應(yīng)和參與防御和應(yīng)激反應(yīng)元件，推測其可能參與了植物體內(nèi)各種逆境脅迫應(yīng)答，為深入揭示蓮藕NnPPO1與NnCAT1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)[46]。組織特異性結(jié)果表明NnPPO1與NnCAT1的表達(dá)模式基本相同，暗示NnCAT1與NnPPO1協(xié)同互作使蓮藕等果蔬褐變，推測 NnPPO1與 NnCAT1在植物中可能具有廣譜的互作關(guān)系，以發(fā)揮更多的作用。蓮藕中含有大量的多酚氧化酶，因此，蓮藕是研究多酚氧化酶比較理想的植物材料。本研究結(jié)果為深入探討蓮藕NnPPO1與NnCAT1的生物學(xué)功能，研究蓮藕PPO的分子作用機(jī)制，精準(zhǔn)抑制其活性奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，從抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)中篩選出NnCAT1與NnPPO1存在蛋白互作；利用BiFC進(jìn)一步證實(shí)NnPPO1與NnCAT1之間的互作關(guān)系，且NnPPO1保守的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域在互作中發(fā)揮主要作用；亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，NnCAT1蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上；組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示NnPPO1與NnCAT1的表達(dá)模式基本相同，都在葉中有最高的表達(dá)量，在莖尖中表達(dá)量最低。