吳 韜，任艷嬌，李偉麗

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）與普通高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法相比具有更好分離度、更快分析速度和更高峰容量等優(yōu)點[1-2]。而高分辨飛行時間質(zhì)譜（high resolution time of flight mass spectrometry，TOF/MS）既可以利用一級質(zhì)譜及二級碎片的準確質(zhì)量數(shù)、離子豐度和標準品等對化合物進行準確定性分析，也可以采用采用多反應(yīng)模式對目標離子對進行定量分析[3-4]。因此超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜同時具備上述2種方法的優(yōu)點，具有高效分離、高分辨率和高靈敏度等特點，已經(jīng)被廣泛用于復(fù)雜體系中目標化合物的檢測。

核苷酸類成分對食物風(fēng)味增鮮有很大的影響，其主要包括以5'-肌苷酸（ionosine-5'-mono-phosphate，IMP）和5'-鳥苷酸（guanosine-5-monophosphate，GMP）為代表的5'-核苷酸及其衍生物[5]。研究表明，IMP、GMP兩種物質(zhì)在肉類中含量豐富，不僅具有顯著的增鮮作用，而且對肉制品的各種風(fēng)味具有一定的增減作用；因此，測定肉類食品中IMP、GMP含量對研究肉類食品風(fēng)味及呈味物質(zhì)之間的相互關(guān)系有著重要的意義[6-8]。國內(nèi)外學(xué)者對食品中核苷酸含量進行了大量研究，常用的檢測方法包括高效液相色譜法，分光光度法、高效毛細管電泳法等[9-12]。

牦牛肉與普通黃牛、水牛肉相比不僅具有低脂肪、低熱量、高蛋白、多種氨基酸、肌肉纖維更豐富等特點。以往研究對牦牛肉中核苷酸研究還不充分，本試驗擬采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-QTOF-MS）技術(shù)，建立對牦牛肉中呈味核苷酸的定性、定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉由四川紅原遛遛牛食品有限責(zé)任公司提供；三氯乙酸（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；IMP標準品、GMP標準品，購自Sigma公司；甲醇（色譜純級），購自Sigma公司；乙酸銨（分析純），購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀，日本島津儀器有限公司；X500飛行時間質(zhì)譜，美國SCIEX公司；BT-25S分析天平，成都世紀方舟科技有限公司；Heto-HSC 500真空冷凍干燥機，上海佰蕾真生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準對照品溶液的配制

分別精確稱量IMP、GMP標準品各1 mg（精確到0.01 mg），加水配制成1 mg/mL標準對照品儲備液。取適量標準儲備液加水逐級稀釋為50×10-6、25×10-6、12.5×10-6、6.25×10-6、3.123 ×10-6、0.312 5×10-6系列標準溶液（標準溶液需當(dāng)天配制）。

1.3.2 樣品前制備

取500 g牛霖肉解凍后，切成0.1 cm厚的薄片于超低溫冰箱預(yù)凍處理5 h后進行真空冷凍干燥，32 h后取出，凍干后的肉片粉碎備用。

1.3.3 樣品制備

精確稱取2.0 g樣品粉末置于15 mL離心管中，加入10 mL 5%三氯乙酸溶液，渦旋震蕩，超聲波處理5 min，15 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，上機待測。

1.3.4 色譜分析條件

色譜柱：采用C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm粒徑)；色譜柱溫度：40 ℃；流動相A為甲醇，流動相B為0.01%乙酸銨-水溶液（V/V）；洗脫梯度如下：0～4 min，2%～98%A；4～6 min，100%A；6～8 min，100%～2%A；流速：0.25 mL/min；進樣量：2 μL。

1.3.5 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），負離子模式；掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；氣簾氣（air curtain，CUR）241 kPa，離子化壓力（ionization pressure，IS）5 500 V，溫度（temperature，TEM）400 ℃，噴霧氣（spray gas，GS1）310 kPa，輔助加熱氣（auxiliary heating gas，GS2）345 kPa，去簇電壓（de-clustered voltage，DP）80 V，碰撞能量（collision energy，CE）10 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～600。

1.4 IMP、GMP提取方法的優(yōu)化

首先采用單因素對提取方法進行初步篩選，試驗采用提取溫度A（20、40、60、80、100 ℃）、提取時間B（10、20、30、40、50 min）、三氯乙酸體積分數(shù)C（1%、3%、5%、7%）對IMP、GMP提取進行研究。根據(jù)單因素分析，選取單因素最佳提取溫度、時間、三氯乙酸體積分數(shù)進行L9（34）正交試驗設(shè)計，通過正交分析，確定IMP和GMP最佳的提取組合。

1.5 方法學(xué)驗證

為驗證方法的準確性，將1.3.2制備的樣品溶液稀釋4倍后，選取高（50 μg/mL）、中（25 μg/mL）、低（12.5 μg/mL）質(zhì)量濃度IMP標準溶液和高（6.25 μg/mL）、中（3.125 μg/mL）、低（0.312 5 μg/mL）質(zhì)量濃度GMP標準溶液，按照加標體積與樣品體積1∶3進行樣品加標，在1.3.3與1.3.4方法條件下每個加標樣品重復(fù)測定6次計算?；|(zhì)效應(yīng)以相同物質(zhì)在基質(zhì)溶液中標準曲線斜率與純?nèi)軇┲袠藴是€斜率來評價基質(zhì)效應(yīng)情況，通過公式（1）計算。

式中：a是基質(zhì)校準曲線的斜率；b是溶劑校準曲線的斜率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Sciex公司的OS軟件采集和定性定量處理分析，采用SPASS 17.0統(tǒng)計軟件對正交結(jié)果數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IMP、GMP提取優(yōu)化分析

為了準確測定樣品中核苷酸的含量，首先采用正交試驗對樣品中核苷酸的提取工藝進行優(yōu)化。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選擇提取溫度20、40、60 ℃，提取時間10、20、30 min，三氯乙酸體積分數(shù)1%、3%、5%進行正交試驗設(shè)計（L934）。

本次試驗選擇IMP和GMP兩個含量為評價指標，因此需要對這兩個指標進行加權(quán)綜合評分[13-15]。由于IMP在樣品中含量遠遠大于GMP，因此設(shè)置IMP權(quán)重為70%、GMP權(quán)重為30%。由表1可知，根據(jù)綜合評分確定影響因素順序為：三氯乙酸體積分數(shù)＞提取時間＞提取溫度，說明三氯乙酸體積分數(shù)在IMP、GMP提取過程中有著重要作用，最佳理論提取條件組合為A2B2C3。由表2知，三氯乙酸體積分數(shù)對IMP、GMP提取具有較大顯著性（P＜0.05），提取時間和提取溫度（P＞0.05）對它的影響不明顯，所以為了節(jié)約試驗時間與成本，選取組合A1B1C3為最佳提取組合，即提取時間10 min、提取溫度20 ℃、三氯乙酸體積分數(shù)5%。

表1 正交試驗結(jié)果

表2 方差分析

2.2 ESI離子源條件下GMP、IMP的定性、定量分析

2.2.1 IMP、GMP裂解機制分析

根據(jù)預(yù)試驗分析得出，GMP和IMP在負離子掃描模式下離子響應(yīng)值強度高于正離子模式，所以本試驗采用負離子掃描模式對它們進行分析。在定量分析之前，首先需要對它們進行裂解機制研究，以便選擇可靠、合適的離子對進行定量分析。圖1為樣品中IMP和GMP的二級色譜圖及其可能的裂解途徑。由圖1（a）可知，IMP母離子m/z 347，產(chǎn)生4個主要碎片離子，分別為m/z 211、m/z 135、m/z 97和m/z 79。其裂解機制為核糖磷酸酯與次黃嘌呤間C—N鍵發(fā)生斷裂形成m/z 211核糖磷酸酯和m/z 135次黃嘌呤，核糖磷酸酯間C—O鍵斷裂形成m/z 97的磷酸，磷酸脫去1個水分子形成m/z 79。圖1（B）為GMP的二級質(zhì)譜圖，由IMP與GMP分子結(jié)構(gòu)看出，GMP在IMP基礎(chǔ)上多了1個氨基，其裂解規(guī)律與IMP相似，其中m/z 150是由次黃嘌呤與氨基結(jié)合形成的鳥嘌呤。

圖1 牦牛肉樣品中呈味核苷酸二級質(zhì)譜圖：（a）IMP，（b）GMP

2.2.2 IMP、GMP定量分析離子對選擇

由圖1可知，可以選擇m/z 211離子作為定性離子，同時為了降低IMP與GMP的檢出限，選擇信號峰最強的離子對（362→79；347→79），采用多反映監(jiān)測模式（MRM）對呈味核苷酸進行定量分析。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

分別將質(zhì)量濃度為0.312 5、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL的IMP、GMP系列標準溶液按照上述色譜、質(zhì)譜條件進樣分析，以峰面積y為縱坐標對核苷酸質(zhì)量濃度x進行回歸計算，繪制標準曲線。表3結(jié)果表明，在0.312 5～50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，IMP和GMP的線性關(guān)系良好。IMP的檢出限與定量限分別為0.06 和0.16 μg/mL，GMP的檢出限與定量限分別為0.03 和0.13 μg/mL，只有高效液相色譜法檢出限的1/15[16-19]，表明UHPLC-QTOF-MS方法對測定IMP和GMP含量具有較高的靈敏度。RSD值小于或等于20%時，方法的精密度良好[20-22]，由測定值可知，IMP與GMP精密度（RSD）分別為3.50%與1.80%，說明該方法符合精密度要求。

表3 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.3.2 方法的加標回收試驗

由表4可知，IMP平均回收率為101.53%，標準偏差為3.63%，GMP平均回收率為96.27%，標準偏差為3.45%。根據(jù)SANTE/11 945/2015歐盟指南[20-22]，回收率在70%～120%的范圍內(nèi)表明回收率良好，由結(jié)果可知，該測定方法的準確度符合要求，研究方法可行。

表4 樣品中呈味核苷酸的回收率（n=6）

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中目標物以外的組分，與目標物共洗脫出的樣品基質(zhì)對目標物的離子化過程產(chǎn)生影響，造成離子化抑制或增強[23]。本試驗基質(zhì)效應(yīng)采用樣品提取溶液直接溶解IMP和GMP標準品，然后用樣品提取溶液對其進行連續(xù)稀釋。因為樣品提取液中IMP含量較高，所以試驗中將1.3.2制備的樣品溶液稀釋4倍后進行標準品的配制及梯度稀釋。最終IMP加標質(zhì)量濃度范圍為16.10～65.78 μg/mL，GMP加標質(zhì)量濃度范圍為0.65～50.33 μg/mL。

研究[24-25]表明，|基質(zhì)效應(yīng)|≥50%被認為具有強的基質(zhì)效應(yīng)，20%≤|基質(zhì)效應(yīng)|＜50%被認為具有一定的基質(zhì)效應(yīng)，|基質(zhì)效應(yīng)|＜20%可認為無基質(zhì)效應(yīng)。同時，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)＞0時，表明該樣品基質(zhì)對目標物離子化過程具有增強作用，基質(zhì)效應(yīng)＜0時認為該樣品基質(zhì)對目標物離子化造成抑制作用。由表5可知，IMP和GMP基質(zhì)效應(yīng)均＜0，說明該樣品基質(zhì)對IMP和GMP的離子化具有抑制作用。IMP的|基質(zhì)效應(yīng)|為26.21%，超過了20%，說明基質(zhì)對其定量分析有影響，因此采用基質(zhì)校準曲線對樣品中IMP的含量進行計算。而GMP的|基質(zhì)效應(yīng)|為16.27%，表明基質(zhì)對GMP的定量分析影響不顯著，因此采用標準曲線直接計算牦牛肉中GMP含量。

表5 基質(zhì)效應(yīng)和校準曲線

2.3.4 樣品中IMP、GMP的定量分析

按照本試驗建立的方法，分別取5塊不同部位的牦牛肉進行定量分析。由表6可知，1號樣品中IMP、GMP含量最高，5號樣品中兩物質(zhì)含量最低。其IMP含量范圍在10.21～32.61 mg/100 g，GMP含量范圍在0.24～0.46 mg/100 g。結(jié)果表明，不同部位的牦牛肉的核苷酸含量差異顯著。

表6 牦牛肉中IMP、GMP定量分析結(jié)果

3 結(jié)論

本文首次建立了UHPLC-QTOF-MS快速測定牦牛肉中IMP和GMP的分析方法。采用正交試驗對提取方法工藝條件進行了優(yōu)化，并對IMP和GMP二級質(zhì)譜的裂解行為進行了詳細解析。方法學(xué)研究表明，本研究建立的方法具有較好的準確性和重復(fù)性，可為牛肉及其他生鮮品中呈味核苷酸的測定提供數(shù)據(jù)及方法支持。