楊超，張彥收，張庚，杜凱鄴，李靜平，劉亮

1河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心，石家莊 050011；2河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究所，石家莊 050011

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率較高，嚴重威脅著女性的生命健康[1]。其常規(guī)治療方法包括手術、化療及放療，其中手術仍是首選方法，但相當一部分患者就診時已屬中晚期，失去了手術治療的機會。因此，化療成為其主要的治療方法之一。影響化療效果的主要因素為化療藥物的毒副作用及耐藥性。尋找高效低毒的抗乳腺癌藥物對提高治療效果、延長生存期具有重要意義。為了尋找低毒的抗癌藥物，目前研究者多傾向于從中草藥中尋找抗癌成分。中藥治療腫瘤歷史悠久且低毒、價廉[2-3]。青蒿素來源于植物黃花蒿，其多種衍生物具有較好的抗瘧作用[4-5]，如青蒿琥酯治療重型及耐藥型瘧疾效果較好[6-9]，還具有調節(jié)免疫[10]、 抗炎、抗氧化[11]及抗腫瘤的作用[12]。有研究發(fā)現，青蒿琥酯具有抗多種腫瘤作用[13-16]，但其作用機制研究鮮有報道。本研究探討青蒿琥酯對乳腺癌細胞的生長抑制作用及其機制，為將青蒿琥酯應用于臨床治療乳腺癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 注射用青蒿琥酯購自桂林南藥股份有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染檢測試劑盒購自美國Beckman Coulter公司；羅丹明123(Rhodanmine 123，Rho123)試劑購自中國Solarbio公司；CCK-8試劑購自中國博士德生物工程有限公司；Bcl-2及Bax抗體購自美國Santa Cruz公司；MatrigelTMMatrix Basement Membrane購自美國BD公司。Transwell 3422購自美國Corning公司；FC-500型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 細胞株 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231由本實驗室傳代培養(yǎng)。接種細胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中(補充青霉素、鏈霉素各100 U/L)，置于37 ℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞增殖抑制實驗 取對數生長期的MDAMB-231細胞，調整細胞濃度至1×104/ml，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2溫箱中。貼壁后倒去培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的青蒿琥酯(0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400、800 μg/ml)，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)液，反應總體積200 μl/孔。另設空白對照孔，只加培養(yǎng)液，每個藥物濃度均設3個復孔，置于37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后，每孔加入CCK-8溶液20 μl，繼續(xù)孵育3 h，終止培養(yǎng)。用酶標儀測定各孔450 nm波長處的吸光度(A450)值，計算生長抑制率(IR)及半數抑制濃度(IC50值)。IR(%)=(1－用藥組A450/對照組A450)×100%。

1.4 細胞實驗分組及青蒿琥酯干預實驗 取對數生長期的MDA-MB-231細胞(5×106個)接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的青蒿琥酯，終濃度分別為0、25、50、100 μg/ml(根據IC50值選擇)，0 μg/ml青蒿琥酯以生理鹽水代替，作為對照組，作用24 h后，收集細胞，PBS液洗滌2次，300目尼龍網過濾制備成合格的單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/ml。每組實驗重復3次。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取1 ml單細胞懸液，用預冷PBS洗滌1次，100 μl預冷1×結合緩沖液懸浮細胞，加入10 μl AnnexinV-FITC，冰上避光放置15 min，加入380 μl 1×結合緩沖液，然后加入10 μl PI染液冰上避光放置15 min，PBS洗滌1次，1 ml PBS懸浮細胞，上流式細胞儀檢測細胞凋亡 情況。

1.6 流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位 取1 ml單細胞懸液，用預冷PBS洗滌1次，100 μl PBS液懸浮細胞，加入Rho123染料，終濃度為10 μg/ml，在37 ℃下避光平衡30 min，PBS洗滌1次，1 ml PBS懸浮細胞，采用流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位。以平均熒光強度表示細胞線粒體膜電位水平。

1.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數生長期的MDA-MB-231細胞(5×106個)接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的青蒿琥酯，終濃度分別為0、25 μg/ml，0 μg/ml青蒿琥酯以生理鹽水代替，作為對照組，作用24 h后，收集細胞。

先用Marker筆在6孔板背后均勻劃線，間隔0.5 cm，橫穿過孔，每孔穿過5條線。在每孔中加入約5×105個上述制備細胞，培養(yǎng)過夜后融合度達到100%。第2天用10 μl槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭垂直，不能傾斜(不同孔之間使用同一只槍頭)。PBS洗滌3次，去除劃下的細胞，加入培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并于0、24 h拍照。

1.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 取對數生長期的MDA-MB-231細胞(5×106個)接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的青蒿琥酯，終濃度分別為0、25 μg/ml，0 μg/ml青蒿琥酯以生理鹽水代替，作為對照組，作用24 h后，收集 細胞。

用Matrigel和無血清RPMI 1640(1:8稀釋)包被Transwell小室底部膜的上室面，每孔加入60 μl稀釋后的Matrigel膠，37 ℃孵育4 h。此間Matrigel膠變?yōu)榘咨珜樱囵B(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50 μl無血清RPMI 1640，37 ℃孵育30 min，取上述收集的細胞去血清饑餓12 h后，向Transwell上室加入無血清RPMI 1640細胞懸液200 μl(含2×104個細胞)，下室加入600 μl全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，移去上室，用棉簽擦去上室細胞，結晶紫染色，于100倍顯微鏡下計數遷移至下室的細胞數量(隨機選取5個視野)。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析。所有數據均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 青蒿琥酯可抑制乳腺癌細胞增殖 CCK-8法檢測結果顯示，青蒿琥酯對MDA-MB-231細胞具有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性(圖1)。青蒿琥酯對MDA-MB-231細胞的IC50為54.24 μg/ml。根據青蒿琥酯對乳腺癌細胞的IC50值，后續(xù)實驗青蒿琥酯濃度選擇0、25、50及100 μg/ml，0 μg/ml青蒿琥酯以生理鹽水代替，作為對照組。

圖1 青蒿琥酯抑制MDA-MB-231細胞增殖曲線圖(CCK-8， n=3)Fig.1 Curative curve of MDA-MB-231 cells treated with artesunate (CCK-8, n=3)

2.2 青蒿琥酯可誘導乳腺癌細胞凋亡 流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較，25、50及100 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231細胞24 h，細胞凋亡率顯著增高(P<0.01)，且呈濃度依賴性。100 μg/ml青蒿琥酯組細胞凋亡率顯著高于25及50 μg/ml青蒿琥酯組(P<0.01，圖2)。

2.3 青蒿琥酯可降低乳腺癌細胞線粒體膜電位 流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較，25、50 及100 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231細胞24 h，細胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)，且呈濃度依賴性。100 μg/ml青蒿琥酯組細胞線粒體膜電位顯著低于25及50 μg/ml青蒿琥酯組(P<0.01， 圖3)。

圖2 青蒿琥酯誘導MDA-MB-231細胞凋亡(流式細胞術，n=3)Fig.2 Apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by artesunate (Flow cytometry, n=3)

2.4 青蒿琥酯可抑制乳腺癌細胞的遷移能力 細胞劃痕實驗檢測結果顯示，25 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231細胞24 h，可以顯著抑制MDAMB-231細胞的遷移能力(圖4)。

2.5 青蒿琥酯可抑制乳腺癌細胞的侵襲能力 Transwell實驗檢測結果顯示，25 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231細胞24 h，侵襲細胞數(42.33±5.51)較對照組(126.00±9.54)明顯減少(P<0.01，圖5)。

3 討 論

目前乳腺癌的常規(guī)治療方法包括手術、化療及放療[17-20]，其中手術是首選的治療方法，但由于諸多原因不能手術的患者往往會選擇化療及放療[21]。影響化療效果的因素主要包括藥物的毒副作用及多藥耐藥，因此尋找高效低毒的抗乳腺癌藥物具有重要意義。

圖3 青蒿琥酯調控MDA-MB-231細胞線粒體膜電位(流式細胞術，n=3)Fig.3 Mitochondrial membrane potential in MDA-MB-231 cells regulated by artesunate (Flow cytometry, n=3)

中藥治療腫瘤歷史悠久，具有低毒、高效、價廉的特點。從中草藥中尋找抗腫瘤藥物已成為目前腫瘤界研究的熱點[22-24]。青蒿素來源于植物黃花蒿，其衍生物青蒿琥酯具有重要的藥效價值。青蒿琥酯是經典的抗瘧藥物，具有低毒、高效的特點，對重型和耐藥型瘧疾療效較好[25-27]。已知青蒿琥酯對多種腫瘤細胞具有生長抑制作用[28-30]。本課題組前期研究發(fā)現，青蒿琥酯對食管癌及胃癌細胞具有生長抑制作用，且其抑制作用與誘導細胞凋亡有 關[31-32]。本研究主要探討青蒿琥酯對乳腺癌細胞的生長抑制作用及可能機制，為其作為抗乳腺癌藥物應用于臨床提供理論依據。本研究發(fā)現，青蒿琥酯對MDA-MB-231細胞具有生長抑制作用，且呈濃度依賴性。

細胞凋亡是受諸多因子調控的程序性細胞死亡，亦是判斷藥物是否具有抗癌作用的主要指標。線粒體是細胞生命活動的控制中心，細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，以及細胞凋亡的調控中心。線粒體跨膜電位下降被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發(fā)生的事件，一旦線粒體跨膜電位劇變，則細胞凋亡將不可逆。本研究結果顯示，青蒿琥酯作用后，MDA-MB-231細胞發(fā)生凋亡，且呈濃度依賴性；細胞線粒體膜電位進一步降低，且隨著青蒿琥酯濃度增高，線粒體膜電位進一步降低。表明青蒿琥酯對乳腺癌細胞的生長抑制作用與誘導細胞凋亡作用有關，細胞線粒體膜電位降低，從而引起細胞凋亡。本研究還發(fā)現，青蒿琥酯可顯著抑制MDAMB-231細胞的遷移及侵襲能力。

圖4 劃痕實驗檢測乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移能力(×100)Fig.4 The migration ability of MDA-MB-231 cells was detected by wound healing test (×100)

圖5 Transwell實驗檢測乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲能力(×200)Fig.5 The invasive ability of MDA-MB-231 cells was detected by Transwell assay (×200)

綜上所述，青蒿琥酯可抑制乳腺癌細胞的生長，降低線粒體膜電位，從而導致細胞凋亡；還可抑制乳腺癌細胞的遷移及侵襲。青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，來源于植物黃花蒿，具有低毒副作用的特點，若能將其開發(fā)為抗乳腺癌藥物，將會有廣泛的應用前景。