甄云鳳，馮靜，唐勇，齊翠娟，甘可欣，費雯婕，溫豐華，宋光耀

河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，石家莊 050031

隨著生活方式的改變，我國2型糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長的趨勢，且合并的心、腦、腎等器官的慢性并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人民群眾的身心健康[1]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病的重要發(fā)病機制，也是糖尿病早期預(yù)防的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。IR主要表現(xiàn)為胰島素敏感的組織或器官(如肝臟、骨骼肌、脂肪組織等)對胰島素的反應(yīng)性或敏感性降 低[2-3]。骨骼肌是葡萄糖、脂質(zhì)攝取及利用的主要器官，體內(nèi)約80%的糖代謝是在骨骼肌內(nèi)完成的，因此闡明骨骼肌IR的機制非常重要。

MicroRNA(又稱miRNA)是一類參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子單鏈RNA，其表達具有高度保守性、組織特異性及發(fā)育階段特異性[4]。目前，對于miRNA的研究主要集中在心血管疾病、糖尿病、肥胖、腫瘤等領(lǐng)域[5-8]。研究顯示，miRNA與糖脂代謝、IR關(guān)系密切，多種miRNA的表達異常與IR有關(guān)，如miRNA-802。深入研究miRNA可能為2型糖尿病的治療帶來全新的方法[9]。Higuchi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與糖耐量正常的人群相比，2型糖尿病患者血清miR-802的水平明顯升高，肥胖小鼠血清、肝臟及骨骼肌組織中的miR-802表達水平高于正常體重小鼠，提示miR-802可能與糖代謝及IR有關(guān)，其具體作用機制值得進一步研究。本研究通過建立IR的L6成肌細胞模型，探討miR-802對骨骼肌細胞糖代謝的影響，以期尋找2型糖尿病的潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 大鼠L6成肌細胞系購自上海生命科學(xué)院，保存于河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心/河北省代謝病重點實驗室。DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，美國ScienCell公司)，Trizol試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)。miR-802模擬物、miR-802抑制劑及轉(zhuǎn)染對照均由銳博(廣州)生物科技有限公司構(gòu)建。miR-802引物、microRNA提取、Real-Time PCR反轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒(天根生化試劑公司)、棕櫚酸(美國Sigma公司)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K，貨號ab32089)、p-PI3K(貨號ab182651)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transport protein 4，GluT4，貨號ab216611)均購自英國Abcam公司，蛋白激酶B(protein kinase B，又稱Akt，貨號3063)及p-Akt(Ser473，貨號4060)均購自美國Cell Signaling 公司。

1.2 方法

1.2.1 L6細胞培養(yǎng)、分化及鑒定 從液氮中取出凍存的L6成肌細胞，迅速放入37 ℃左右的水中復(fù)溫，使凍存的細胞盡快融化后轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基(10%胎牛血清，DMEM，1%青霉素、鏈霉素)的培養(yǎng)瓶中，吹打混勻后置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換新的培養(yǎng)基。當(dāng)L6成肌細胞生長達到貼壁面積的60%左右時，此時期的L6肌細胞為未分化組，更換細胞培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基(2%胎牛血清，97%DMEM，1%青霉素、鏈霉素)，細胞分化5 d后為分化組。收集細胞并提取其總RNA，采用RT-PCR方法檢測分化組與未分化組的骨骼肌分化標(biāo)志性基因Desmin及Myogenin的mRNA表達量，從基因水平鑒定分化是否成功。

1.2.2 L6成肌細胞IR體外模型的建立及鑒定 細胞分化成功后，更換培養(yǎng)基為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)12 h。用0.4 mmol/L棕櫚酸(palmitic acid，PA)孵育細胞24 h，為棕櫚酸干預(yù)組，對照組加同樣體積的空白溶液。模型鑒定方法如下[11]：棄去原培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞3次，用含有100 nmol/L胰島素的正常培養(yǎng)基孵育兩組細胞24 h后，采用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中剩余葡萄糖含量。

1.2.3 L6成肌細胞的轉(zhuǎn)染及miR-802、PI3K、Akt和GluT4 mRNA表達水平檢測 當(dāng)誘導(dǎo)分化成功的L6成肌細胞濃度達到約60%時，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000的操作說明分別轉(zhuǎn)染miR-802的模擬物和抑制劑。將細胞分為5組：正常對照組、棕櫚酸組、棕櫚酸+miR-802模擬物組、棕櫚酸+ miR-802抑制劑組、棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組。轉(zhuǎn)染成功后分別提取miRNA和總RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用realtime PCR分析miR-802、PI3K、Akt和GluT4 mRNA表達水平。

1.2.4 骨骼肌細胞蛋白的提取 將待處理的細胞用含100 nmol/L胰島素的培養(yǎng)基刺激30 min后，棄去原有培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，倒置于冰板上約10 min，每瓶內(nèi)加入800 μl裂解液，4 ℃裂解45 min，使細胞充分裂解。裂解結(jié)束后，用細胞輕刮培養(yǎng)瓶底，整個過程均在冰板上進行。然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，4 ℃下12 000×g離心30 min。離心結(jié)束后，將上清液轉(zhuǎn)移至另一EP管，按蛋白樣品:5×上樣緩沖液為4:1的比例加入上樣緩沖液，充分混勻后，95 ℃加熱5 min，每管100 μl分裝，得到蛋白樣品電泳加樣液，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Western blotting檢測各組PI3K、Akt及GluT4蛋白的表達水平 配制6%濃縮膠及12%分離膠備用，濕轉(zhuǎn)至PDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液于37 ℃孵育30 min。加入兔抗PI3K、抗p-PI3K抗體、抗Akt、抗p-Akt、抗GluT4-抗體和抗β-action抗體孵育(1:6000)，4 ℃過夜，最后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，β奈酚磷酸顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)對X線片照相，用AlphaEase FC軟件進行條帶分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，兩樣本均數(shù)呈正態(tài)分布且方差齊時，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 L 6 成肌細胞的分化鑒定 分化組細胞的Desmin mRNA表達水平(3.56±0.63)明顯高于未分化組(0.80±0.09)，Myogenin mRNA表達水平(4.01±0.59)亦明顯高于未分化組(0.78±0.42)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.496、13.297，P＜0.05)，提示L6成肌細胞分化成功。

2.2 L6成肌細胞IR體外模型的建立 棕櫚酸組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度[(20.46±1.52) mmol/L]明顯高于正常對照組[(14.36±1.38) mmol/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.522，P＜0.05)，提示其胰島素敏感性下降，IR模型建立成功。

2.3 各組L6成肌細胞中miR-802 mRNA表達水平比較 與正常對照組(1.458±0.264)相比，棕櫚酸組(3.108±0.513)、棕櫚酸+miR-802模擬物組(11.743±0.933)、棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組(3.442±0.104)的miR-802 mRNA表達均升高；與棕櫚酸組相比，棕櫚酸+miR-802模擬物組的miR-802 mRNA表達明顯升高，而棕櫚酸+miR-802抑制劑組的miR-802 mRNA表達(1.069±0.056)明顯降低；與棕櫚酸+miR-802模擬物組相比，棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組及棕櫚酸+miR-802抑制劑組的miR-802 mRNA水平均降低；與棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組相比，棕櫚酸+miR-802抑制劑組的miR-802 mRNA水平降低 (圖1)，提示miR-802的模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染成功。

圖1 各組L6成肌細胞miR-802 mRNA表達水平比較(±s, n=6)Fig.1 Comparison on mRNA expression of miR-802 in L6 myoblasts (±s, n=6)

2.4 各組PI3K、Akt及GluT4 mRNA表達水平比較 與正常對照組相比，棕櫚酸組、棕櫚酸+miR-802模擬物組、棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組L6成肌細胞PI3K、Akt及GluT4 mRNA表達水平下降；與棕櫚酸組相比，棕櫚酸+miR-802模擬物組PI3K、Akt及GluT4 mRNA表達下降，棕櫚酸+miR-802抑制劑組PI3K、Akt及GluT4 mRNA表達升高；與棕櫚酸+miR-802模擬物組相比，棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組及棕櫚酸+miR-802 抑制劑組PI3K、Akt及GluT4 mRNA表達均升高；與轉(zhuǎn)染對照組相比，棕櫚酸+miR-802抑制劑組PI3K、Akt和GluT4 mRNA表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.5 各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及GluT4的蛋白表達水平比較 與正常對照組相比，棕櫚酸組、棕櫚酸+miR-802模擬物組、棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組L6成肌細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及GluT4蛋白表達水平均下降；與棕櫚酸組相比，棕櫚酸+miR-802模擬物組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及GluT4蛋白表達水平下降，棕櫚酸+miR-802抑制劑組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及GluT4蛋白表達水平均升高；與棕櫚酸+miR-802模擬物組相比，棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組及棕櫚酸+miR-802抑制劑組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及GluT4蛋白表達水平均升高；與轉(zhuǎn)染對照組相比，棕櫚酸+miR-802抑制劑組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及GluT4蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2，表1)。

表1 各組PI3K、Akt及GluT4 mRNA及蛋白的表達水平比較(±s, n=6)Tab.1 The mRNA and protein expressions of PI3K, Akt and GluT4 in each group (±s, n=6)

表1 各組PI3K、Akt及GluT4 mRNA及蛋白的表達水平比較(±s, n=6)Tab.1 The mRNA and protein expressions of PI3K, Akt and GluT4 in each group (±s, n=6)

與正常對照組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05；與棕櫚酸組比較，(3)P<0.01，(4)P<0.05；與棕櫚酸+miR-802模擬物組比較， (5)P<0.01，(6)P<0.05；與棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組比較，(7)P<0.05，(8)P<0.01。

組別 PI3K Akt GluT4 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白正常對照組 0.977±0.039 0.542±0.021 0.985±0.033 0.989±0.010 0.946±0.058 0.877±0.052棕櫚酸組 0.724±0.032(1) 0.349±0.056(1) 0.819±0.044(1) 0.639±0.002(1) 0.719±0.038(2) 0.648±0.028(1)棕櫚酸+miR-802模擬物組 0.494±0.025(1)(3) 0.195±0.026(1)(3) 0.754±0.028(1)(3) 0.261±0.075(1)(3) 0.427±0.031(4) 0.413±0.096(1)(3)棕櫚酸+轉(zhuǎn)染對照組0.682±0.059(1)(5) 0.351±0.019(1)(5) 0.718±0.033(1)(5) 0.557±0.040(1)(5) 0.666±0.056(1)(6) 0.590±0.026(1)(5)棕櫚酸+miR-802抑制劑組 0.887±0.016(3)(5)(7) 0.494±0.012(3)(5)(7) 0.814±0.026(3)(5)(8) 0.951±0.031(3)(5)(7) 0.908±0.054(4)(5)(7) 0.756±0.007(4)(5)(7)F 18.927 20.922 53.827 21.876 11.160 17.529 P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01 0.01 <0.01

圖2 各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及GluT4蛋白表達 水平Fig.2 The protein expressions of PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt and GluT4 in each group

3 討 論

MiRNA是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在哺乳動物轉(zhuǎn)錄后基因表達中起重要作用，可通過結(jié)合mRNA 3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)抑制靶基因轉(zhuǎn)錄或使其降解[12-13]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA與IR、糖尿病及其微血管并發(fā)癥密切相關(guān)，在胰島素合成、分泌及胰島素在周圍組織中的抵抗中也起重要作 用[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-375是胰島β細胞葡萄糖代謝和胰島素分泌的有效調(diào)節(jié)因子，可能是β細胞發(fā)育成熟的決定因素[16]。體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-155的表達后，小鼠空腹及餐后血糖均下降，且伴有體重減輕[17]，提示miR-155的表達與IR呈負相關(guān)。與正常對照者相比，伴有微血管并發(fā)癥的2型糖尿病患者血清中miR-661、miR-571和miR-892b等表達明顯升高，提示這些miRNA與微血管并發(fā)癥顯著相關(guān)[18]。

IR是指外周靶器官(骨骼肌、脂肪組織、肝臟)對生理劑量胰島素的反應(yīng)減弱，最終導(dǎo)致糖代謝能力下降[19-20]。骨骼肌是胰島素作用的主要靶器官之一，體內(nèi)約80%的糖代謝是在骨骼肌內(nèi)完成 的[21]，因此闡明骨骼肌IR的機制非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血清、肝臟、胰腺及骨骼肌組織中miR-802的表達水平均較糖耐量正常組升高，體內(nèi)及體外實驗發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)胰腺中miR-802的表達可以影響胰島素的轉(zhuǎn)錄和分泌，進而引起葡萄糖代謝的異常，表明miR-802與胰島素分泌及糖代謝密切相關(guān)，但對其在骨骼肌組織中的作用未進一步進行驗 證[10,22]。本研究發(fā)現(xiàn)，IR模型的L6肌細胞中miR-802表達水平較正常對照組升高，胰島素信號通路的關(guān)鍵基因(PI3K、Akt)及骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GluT4)表達均減少，因此，筆者推測miR-802可能通過調(diào)控骨骼肌胰島素信號通路而影響葡萄糖 代謝。

胰島素作用的主要信號通路是PI3K-Akt途徑，PI3K是調(diào)節(jié)糖代謝的關(guān)鍵蛋白，Akt是位于其下游的重要的蛋白激酶，參與多種信號通路，在糖原和蛋白合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運、細胞凋亡等方面發(fā)揮重要的作用。GluT4主要表達于骨骼肌和脂肪組織，在骨骼肌細胞膜中負責(zé)葡萄糖的轉(zhuǎn)運和攝取，進而在糖代謝過程中發(fā)揮重要作用。IR可影響骨骼肌細胞PI3K、Akt和GluT4的表達及功能，進而調(diào)節(jié)骨骼肌細胞的葡萄糖攝取能力，引起糖代謝紊亂[23]。

本研究采用棕櫚酸孵育L6成肌細胞的方法構(gòu)建IR模型，在此模型上通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)miR-802的表達后，發(fā)現(xiàn)骨骼肌細胞中PI3K及Akt的表達是降低的，且伴有GluT4表達降低，提示胰島素敏感性下降，且伴有骨骼肌細胞對葡萄糖轉(zhuǎn)運能力的下降；在棕櫚酸組，通過轉(zhuǎn)染miR-802抑制劑下調(diào)miR-802表達后，骨骼肌細胞PI3K及Akt的磷酸化水平均升高，GluT4的表達增加，改善了骨骼肌細胞胰島素信號的傳導(dǎo)，增加了葡萄糖攝取及轉(zhuǎn)運。提示miR-802可能通過調(diào)節(jié)骨骼肌細胞PI3K-Akt通路來影響胰島素敏感性及葡萄糖代謝。

綜上所述，棕櫚酸誘導(dǎo)IR的L6成肌細胞中miR-802表達升高，調(diào)節(jié)miR-802的表達可以影響胰島素信號傳導(dǎo)及葡萄糖穩(wěn)態(tài)，但其作用的具體靶基因尚不清楚。筆者下一步將通過基因芯片技術(shù)或靶基因預(yù)測網(wǎng)站篩選并驗證miR-802調(diào)節(jié)骨骼肌糖代謝及胰島素敏感性的靶基因，為2型糖尿病及肥胖的治療提供新的理論基礎(chǔ)及作用靶點。