王宏璐，黃文靜，黃志偉，原尚奇，解詩雨，吳楠

二維相關(guān)中紅外光譜判別牛奶中的四環(huán)素

王宏璐，黃文靜，黃志偉，原尚奇，解詩雨，吳楠通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384）

基于二維相關(guān)中紅外光譜法，建立一種快速判別牛奶中四環(huán)素的分析方法。分別配置20個(gè)純牛奶和20個(gè)摻雜四環(huán)素牛奶樣品（濃度區(qū)間為0.005～30 mg/L）。室溫下，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)采集牛奶樣品的常規(guī)一維譜數(shù)據(jù)。以牛奶中摻雜四環(huán)素濃度為外擾，分別在1 500～1 700 cm-1和3 250～3 450 cm-1波段區(qū)間內(nèi)構(gòu)建同步和異步二維相關(guān)譜，研究其相關(guān)譜特性。通過對(duì)同步譜中交叉峰的正負(fù)以及異步譜中相同位置是否存在交叉峰，推斷1 550 cm-1和1 640 cm-1處所對(duì)應(yīng)的基團(tuán)吸收峰來自于牛奶中的四環(huán)素，是由C＝＝N鍵和C＝＝O鍵的伸縮振動(dòng)引起的。同時(shí)，在3 310 cm-1處的波峰也來自于四環(huán)素，是由N－－H拉伸及彎曲振動(dòng)引起的。結(jié)果表明，對(duì)二維相關(guān)中紅外光譜特性的研究，可以定性判別牛奶中是否摻雜四環(huán)素。

牛奶；四環(huán)素；中紅外光譜；二維相關(guān)

近些年，人們對(duì)牛奶的需求日益增加，牛奶的質(zhì)量是消費(fèi)者挑選牛奶的首要因素。牛奶中摻雜的有害物質(zhì)會(huì)影響人類健康，降低牛奶品質(zhì)，所以，建立牛奶摻雜物質(zhì)準(zhǔn)確、快速的檢測方法是必需的。紅外光譜分析法因具有方便快捷和在線檢測等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)廣泛運(yùn)用在各種摻雜物質(zhì)的判別上[1]。例如，中紅外光譜法（Mid infrared，MIR）可以在不破壞樣品的情況下對(duì)牛奶中的微量物質(zhì)進(jìn)行有效提取分析[2]。但由于待檢測物成分復(fù)雜，外界條件等因素的影響，常規(guī)的一維光譜技術(shù)對(duì)摻雜物的解析及定性定量分析都存在一定的困 難[3]。二維相關(guān)光譜技術(shù)因具有更高的分辨率和圖譜解析能力，可以區(qū)分一些不明顯的、被覆蓋的波峰，通過交叉峰的正負(fù)對(duì)比和基團(tuán)吸收峰強(qiáng)度變化來判斷某純物質(zhì)中是否摻雜其他物質(zhì)。例如，當(dāng)濃度等因素影響樣品體系時(shí)，樣品的各種化學(xué)成分會(huì)“選擇性”的變化，從而得到特定的二維相關(guān)譜圖[4]。由于二維相關(guān)光譜法的良好解析能力，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于牛奶及其他物質(zhì)中各種摻雜物的判別分析[5-10]。隨著市場需求的不斷增長，養(yǎng)殖戶使用的獸藥數(shù)量持續(xù)攀升，四環(huán)素是四環(huán)素類抗生素中最基本的化合物，也是牛奶中常見的抗生素之一[11-12]。四環(huán)素具有很好的抗菌作用，主要用于治療衣原體感染的疾病，其毒性不大，但副作用多見，如惡心、嘔吐，食欲減退，二重感染，影響骨骼和牙齒生長等[12]。本文研究牛奶中四環(huán)素的二維相關(guān)中紅外（MIR－MIR）光譜特性，探討利用二維相關(guān)光譜鑒別純牛奶和摻雜四環(huán)素牛奶的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

本試驗(yàn)采用在超市購買的某品牌同一批次的純牛奶。四環(huán)素標(biāo)品粉末購自Solarbio（純度＞99%）。四環(huán)素母液由超純水制備（100 mg/L），并在4 ℃下儲(chǔ)存。用超純水稀釋母液制備不同濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。在10 mL牛奶樣品中加入10 μL的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，所造成的牛奶樣品的體積變化忽略不計(jì)。共配制10個(gè)不同濃度梯度的四環(huán)素?fù)诫s牛奶，濃度分別為0.005、0.02、0.06、0.1、0.4、0.8、2、6、10和30 mg/L。每個(gè)濃度梯度設(shè)2個(gè)重復(fù)，共獲得20份四環(huán)素?fù)诫s牛奶樣品。同時(shí)，準(zhǔn)備了20份純牛奶樣品。用中紅外儀采集了40個(gè)樣品的光譜數(shù)據(jù)。

1.2 光譜采集

采用美國PerkinElmer公司的傅里葉變換中紅外光譜儀，在室溫下對(duì)牛奶樣品進(jìn)行光譜采集。樣品池為儀器自配的衰減全反射附件。中紅外光譜的掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為 4 cm-1，掃描間隔為8 cm-1，掃描次數(shù)為 8次，每個(gè)濃度樣品測量2次。

1.3 分析方法

利用unscrambler分析程序，對(duì)輸入的摻雜牛奶光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正，采用Savitzky－ Golary方法對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑預(yù)處理，減少對(duì)判別模型的干擾。利用2D－shige軟件構(gòu)建二維相關(guān)譜。以平均譜作為參考，得到二維紅外相關(guān)圖。在同步譜等高線圖中，若有來源相同的兩個(gè)物質(zhì)，則在譜圖中交叉峰體現(xiàn)為正相關(guān)，若兩物質(zhì)來源不相同，交叉峰顯示為負(fù)相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 純牛奶和摻雜四環(huán)素牛奶的中紅外光譜圖

圖1是20個(gè)純牛奶和20個(gè)摻雜不同濃度四環(huán)素牛奶樣品在全波段的中紅外光譜圖。由圖1可以發(fā)現(xiàn)，純牛奶和摻雜四環(huán)素牛奶樣品的中紅外光譜圖有較好的重合度，峰值都大致出現(xiàn)在 1 068、1 540、1 640、1 740、2 916 cm-1和3 450 cm-1左右。這表明簡單地通過一維譜形狀和譜峰位置很難判別牛奶中是否摻雜四環(huán)素。

圖1 純牛奶（a）和摻雜四環(huán)素牛奶（b）樣品的中紅外光譜圖

2.2 二維相關(guān)譜1 500～1 700 cm-1波段區(qū)間

以牛奶中摻雜的四環(huán)素濃度為外擾，隨著濃度的增大，在1 500～1 700 cm-1波段內(nèi)有明顯的光譜信息變化，因此選取這一波段來研究摻雜四環(huán)素牛奶的二維相關(guān)光譜特性。在此區(qū)間構(gòu)建同步二維相關(guān)中紅外譜和其對(duì)應(yīng)的自相關(guān)譜（圖2）。同時(shí)構(gòu)建摻雜四環(huán)素牛奶的異步二維相關(guān)譜（圖3）。同步二維相關(guān)譜是關(guān)于對(duì)角線對(duì)稱的，在對(duì)角線上出現(xiàn)的交叉峰為自相關(guān)峰且總是正的，表明牛奶中四環(huán)素濃度變化引起的光譜強(qiáng)度變化的程度。之前文獻(xiàn)報(bào)道過在1 200～1 700 cm-1，摻雜牛奶與純牛奶間可能存在細(xì)微差別，其中包含有摻雜物的光譜信息；而在900～1 200 cm-1，其光譜信息主要由純牛奶的固有組分所引起[7]。圖2顯示，在1 550 cm-1處出現(xiàn)自相關(guān)峰，這主要是由四環(huán)素中C＝＝N鍵的伸縮振動(dòng)引起的[4]。而在1 640 cm-1處出現(xiàn)的自相關(guān)峰是由于四環(huán)素中的C＝＝O伸縮振動(dòng)引起的[13]。

在圖2a中，可以觀察到在對(duì)角線外有3個(gè)較強(qiáng)的交叉峰出現(xiàn)，分別在（1 550，1 640），（1 640，1 590）和（1 550，1 590）cm-1處。進(jìn)一步判斷交叉峰的正負(fù)可知，在（1 550，1 640）cm-1處交叉峰為正值，表明1 550和1 640 cm-1處的2個(gè)波峰所對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)都來自于同一物質(zhì)。而在異步譜 1 550和1 640 cm-1處并未出現(xiàn)交叉峰（圖3），進(jìn)一步說明1 550和1 640 cm-1處的波峰來自于同一物質(zhì)，即牛奶中的四環(huán)素。此外，圖2a顯示，在（1 640，1 590）和（1 550，1 590）cm-1處的交叉峰為正值，異步譜（圖3）進(jìn)一步顯示，在（1 640，1 590）和（1 550，1 590）cm-1處均出現(xiàn)了交叉峰，表明所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的變化速率不同。說明1 640和1 590 cm-1處，以及1 590和1 550 cm-1處的波峰分別來自于不同的物質(zhì)。綜上，1 550和1 640 cm-1處所對(duì)應(yīng)的基團(tuán)吸收峰來自牛奶中的四環(huán)素，而 1 590 cm-1處所對(duì)應(yīng)的吸收峰可能來自純牛奶中的物質(zhì)。

圖2 1 500～1 700 cm-1波段下?lián)诫s四環(huán)素牛奶的二維相關(guān)中紅外（a）同步譜與（b）自相關(guān)譜

圖3 1 500～1 700 cm-1波段下?lián)诫s四環(huán)素牛奶的異步二維相關(guān)中紅外譜

2.3 二維相關(guān)譜3 250～3 450 cm-1波段區(qū)間

以牛奶中摻雜的四環(huán)素濃度為外擾，在3 250～3 450 cm-1區(qū)間構(gòu)建同步二維相關(guān)中紅外同步譜和其對(duì)應(yīng)的自相關(guān)譜（圖4）。從圖4可以看出，在3 310 cm-1處出現(xiàn)自相關(guān)峰，這個(gè)自相關(guān)峰主要來自于四環(huán)素中N－－H拉伸振動(dòng)及其彎曲振動(dòng)[13]。Qin等[14]在利用中紅外光譜研究四環(huán)素類抗生素粉末樣品過程中，也發(fā)現(xiàn)四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素、金霉素等均在3 310 cm-1附近有特征峰，這可能是由于四環(huán)素類物質(zhì)具有相同的分子結(jié)構(gòu)。根據(jù)上述對(duì)摻雜四環(huán)素牛奶的二維相關(guān)中紅外光譜特性的研究，可以定性判定牛奶中是否摻雜四 環(huán)素。

圖4 3 250～3 450 cm-1波段下?lián)诫s四環(huán)素牛奶的二維相關(guān)中紅外同步譜與（a）自相關(guān)譜（b）

3 結(jié)論

本研究利用二維相關(guān)中紅外光譜法對(duì)純牛奶中摻雜的四環(huán)素（所摻四環(huán)素濃度為0.005～ 30 mg/L）進(jìn)行判別分析。研究發(fā)現(xiàn)，在1 500～ 1 700 cm-1波段中，1 550和1 640 cm-1處所對(duì)應(yīng)的基團(tuán)吸收峰來自于牛奶中的四環(huán)素中C＝＝N鍵和C＝＝O鍵的伸縮振動(dòng)。在3 250～3 450 cm-1波段，3 310 cm-1處的自相關(guān)峰來自于N－－H拉伸振動(dòng)及其彎曲振動(dòng)。這一結(jié)果表明，二維相關(guān)光譜法彌補(bǔ)了一維譜技術(shù)的不足，能將更弱的變化信息體現(xiàn)出來。對(duì)二維相關(guān)光譜圖的分析，可以有效區(qū)分純牛奶和摻雜四環(huán)素牛奶。未來，也可將二維相關(guān)光譜法的結(jié)果與化學(xué)計(jì)量法結(jié)合，進(jìn)一步對(duì)牛奶中的四環(huán)素進(jìn)行定量分析。

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Identification of tetracycline in milk by two-dimensional correlation mid infrared spectroscopy

WANG Hong-lu, HUANG Wen-jing, HUANG Zhi-wei, YUAN Shang-qi, XIE Shi-yu, WU NanCorresponding Author

（College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Based on the two-dimensional correlation mid infrared spectroscopy, a rapid method for the identification of tetracycline in milk was established. 20 pure milk samples and 20 tetracycline adulterated milk samples（0.005～30 mg/L）were prepared respectively. At room temperature, the conventional one-dimensional spectral data of milk samples were collected in the range of 400～4 000 cm-1. Taking the concentration of tetracycline in milk as the external perturbation, synchronous and asynchronous two-dimensional correlation spectra were constructed in the range of 1 500～1 700 cm-1and 3 250～3 450 cm-1, respectively. The absorption peaks at 1 550 cm-1and 1 640 cm-1were supposed to come from the tetracycline in milk, which were caused by the stretching vibration of C＝＝N and C＝＝O bonds. At 3 310 cm-1, the peak also came from tetracycline, which was caused by the stretching and bending vibration of N－－H bond. The results showed that the analysis of two-dimensional correlation mid infrared spectral characteristics can qualitatively determine whether the milk is adulterated with tetracycline.

milk; tetracycline; mid infrared spectroscopy; two-dimensional correlation

1008-5394（2020）03-0079-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.018

O657.33

A

2019-12-10

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201910061090）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21607114，41771357）

王宏璐（2000-），女，本科在讀，主要從事環(huán)境與新能源方面的研究。E-mail：809048865@qq.com。

吳楠（1984-），女，副教授，博士，主要從事環(huán)境污染物方面的研究。E-mail：nwu@tjau.edu.cn。

責(zé)任編輯：楊霞