宋亞芳，夏伯候，楊紅，龔慕辛

子芩與枯芩超高效液相色譜指紋圖譜及模式識別研究

宋亞芳1，夏伯候2，楊紅1，龔慕辛1

1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

建立子芩與枯芩的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，為黃芩藥材的鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。采用UPLC對22批不同產(chǎn)地的子芩、枯芩進(jìn)行測定，建立其特異性指紋圖譜；運用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）對其進(jìn)行模式識別研究，分類并篩選其主要差異性成分，并通過對照品比對進(jìn)行鑒定。建立的子芩和枯芩UPLC指紋圖譜穩(wěn)定可靠，可用于評價兩者的差異性；得到15個共有峰，各產(chǎn)地樣品指紋圖譜相似度較高。PCA不能完全區(qū)分子芩與枯芩，OPLS-DA能對子芩與枯芩進(jìn)行明確區(qū)分，導(dǎo)致差異的主要成分有3個，經(jīng)鑒定分別為黃芩新素Ⅱ、千層紙素A和黃芩素，且三者在子芩與枯芩中含量變化顯著。本研究建立的指紋圖譜和模式識別方法相結(jié)合能夠區(qū)分子芩與枯芩，可作為黃芩質(zhì)量控制和評價的有效手段之一。

黃芩；超高效液相色譜法；指紋圖譜；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析

黃芩為唇形科植物黃芩Georgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎功效[1]?！端幤坊x》提到“一品宜分兩用，蓋枯芩體輕主浮，專清肺胃上焦之火，而條芩體重主降，專瀉大腸下焦之火”。2年采收者，根堅實，稱為“子芩”；3年以上采收者，老根中空，稱為“枯芩”。兩者成分含量及藥效均有一定差異[2-4]。傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗是將二者區(qū)別使用，但目前臨床除少數(shù)醫(yī)生特殊要求外，無論治療上焦肺熱證還是腹瀉等下焦病證均直接使用黃芩飲片，不再對黃芩進(jìn)行子芩和枯芩的區(qū)別使用，藥材市場、藥店及醫(yī)院也無枯芩、子芩區(qū)別銷售。由于子芩生長時間短，且能滿足《中華人民共和國藥典》的質(zhì)量要求，可在相對降低生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上增加藥農(nóng)收入，故市場銷售以子芩居多。

指紋圖譜具有專屬性、唯一性、整體性等特點，適合對中藥進(jìn)行整體的質(zhì)量控制。中藥作為一個多組分體系，必須從整體上評價其質(zhì)量體系。模式識別方法是一種切合中藥指紋圖譜分析的技術(shù)，可有效解決中藥質(zhì)量多維信息的綜合分析問題。本研究收集22批不同產(chǎn)地的子芩和枯芩藥材，建立黃芩藥材的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜；通過主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）方法分析子芩與枯芩UPLC指紋圖譜的差異性，篩選導(dǎo)致樣品間差異的化學(xué)成分并進(jìn)行鑒定，為黃芩藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和含量測定指標(biāo)選擇提供依據(jù)，以期更好地指導(dǎo)臨床用藥。

1 儀器與試藥

Nexera UHPLC LC-30（SPD-M3OA光電二極管陣列紫外可見檢測器），島津公司；SK2200LHC型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Secura225D-1CN分析電子天平（十萬分之一），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HY-04型高速粉碎機(jī)，北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司。

對照品黃芩新素Ⅱ（批號55084-08-7）、野黃芩苷（批號27740-01-8）、千層紙素A-7（批號36948- 76-2）、黃芩素（批號491-67-8）、黃芩苷（批號21967- 41-9）、漢黃芩素（批號632-85-9）、木蝴蝶苷-A（批號57396-78-8）、漢黃芩苷（批號51059-44-0）、千層紙素A（批號480-11-5），成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均大于98%；乙腈為HPLC級（德國默克），其他試劑為分析純，水為娃哈哈純凈水。22批子芩、枯芩藥材來自甘肅、山西、內(nèi)蒙古、河北、陜西等主產(chǎn)區(qū)（見表1），經(jīng)全值大藥房鄭娟中藥師鑒定為唇形科植物黃芩Georgi的干燥根。

表1 22批黃芩藥材樣品來源信息

編號購買地產(chǎn)地樣品 編號購買地產(chǎn)地樣品 S1河北安國河北子芩 S12河北安國陜西枯芩 S2河北安國陜西子芩 S13河北安國陜西枯芩 S3河北安國甘肅子芩 S14河北安國山西枯芩 S4北京海淀山西子芩 S15河北安國河北枯芩 S5河北安國山西子芩 S16河北安國陜北枯芩 S6江蘇蘇州甘肅子芩 S17河北安國內(nèi)蒙古枯芩 S7河北安國甘肅子芩 S18河北安國山西枯芩 S8河北安國甘肅子芩 S19河北安國山西枯芩 S9北京順義山西子芩 S20河北安國內(nèi)蒙古枯芩 S10河北安國山西子芩 S21北京順義甘肅枯芩 S11河北安國山西子芩 S22河北安國山西枯芩

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

取對照品黃芩新素Ⅱ、野黃芩苷、千層紙素A-7、黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素、木蝴蝶苷-A、漢黃芩苷、千層紙素A適量，精密稱定，用70%乙醇溶解，分別制成濃度為0.09、0.08、0.03、0.06、0.20、0.08、0.08、0.06、0.03 mg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液制備

取黃芩樣品粉末（過80目篩）約0.2 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?00 W，頻率53 kHz）40 min，取出，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量[5]，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：InertsilTMODS-3（2.1 mm×100 mm，2 μm）；流速：0.3 mL/min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：5 μL；流動相：乙腈（A）-0.2%冰醋酸水（B），梯度洗脫（0～8 min，20%A；8～15 min，26%A；15～25 min，26%～60%A；25～35 min，60%～100%A；35～40 min，100%A）。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

取枯芩樣品（S21），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算野黃芩苷、木蝴蝶苷-A、黃芩苷、千層紙素A-7、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、黃芩新素Ⅱ、千層紙素A的峰面積RSD分別為1.76%、1.04%、0.49%、0.45%、0.22%、0.19%、0.44%、0.89%、0.57%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取枯芩樣品（S21），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在室溫下分別放置0、4、8、12、24 h，進(jìn)樣分析，計算野黃芩苷、木蝴蝶苷-A、黃芩苷、千層紙素A-7、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、黃芩新素Ⅱ、千層紙素A的峰面積RSD分別為1.50%、0.16%、0.72%、0.63%、0.28%、0.27%、0.58%、1.91%、0.42%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗

取枯芩樣品（S21），按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，計算野黃芩苷、木蝴蝶苷-A、黃芩苷、千層紙素A-7、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、黃芩新素Ⅱ、千層紙素A的峰面積RSD分別為1.92%、0.24%、0.81%、1.05%、0.82%、0.67%、0.44%、1.94%、0.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 數(shù)據(jù)分析方法

利用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2008版V1.1）對22批供試品溶液色譜圖各色譜峰的保留時間和峰面積等數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，并進(jìn)行對數(shù)變換。所得數(shù)據(jù)均導(dǎo)入SIMCA-P+15軟件，利用化學(xué)計量學(xué)方法PCA和OPLS-DA對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.6 指紋圖譜分析

2.6.1 共有峰確定與指認(rèn)

為進(jìn)一步確認(rèn)化合物的結(jié)構(gòu)信息，利用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2008版V1.1）得出19個共有峰，經(jīng)與對照品比對，確定峰4（保留時間4.942）為野黃芩苷，峰5（保留時間9.391）為木蝴蝶苷-A，峰6（保留時間10.044）為黃芩苷，峰10（保留時間14.681）為千層紙素A-7，峰11（保留時間17.313）為漢黃芩苷，峰12（保留時間20.944）為黃芩素，峰13（保留時間24.244）為漢黃芩素，峰14（保留時間24.699）為黃芩新素Ⅱ，峰15（保留時間24.852）為千層紙素A。見圖1。

圖1 22批黃芩藥材UPLC指紋圖譜

2.6.2 相似度評價

對22批黃芩藥材樣品進(jìn)行指紋圖譜測定，采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2008版V1.1）計算相似度，結(jié)果22批樣品指紋圖譜的相似度均大于0.9，見表2。相似度評價結(jié)果表明，從共有峰相似度角度來看，子芩與枯芩的化學(xué)成分總體差異不顯著，這些差異可能來源于某一類成分或同一成分含量的微小變化。因此，本研究進(jìn)一步采用化學(xué)模式識別方法對子芩和枯芩的化學(xué)成分差異進(jìn)行分析。

表2 22批黃芩樣品UPLC指紋圖譜相似度評價結(jié)果

編號相似度 編號相似度 編號相似度 S10.965 S90.997 S170.996 S20.995 S100.998 S181.000 S30.998 S110.992 S190.998 S40.998 S120.998 S200.997 S50.999 S131.000 S210.999 S60.999 S141.000 S220.998 S70.987 S150.994 S80.942 S160.999

2.6.3 基于主成分分析的差異模型建立

PCA作為無監(jiān)督的多元統(tǒng)計方法，在不指定樣本類型的情況下提供了多元信息的無偏和最小損失方法，因此可以代表最原始的樣品分類或差異性信息[6]。從不同產(chǎn)地子芩和枯芩UPLC指紋圖譜PCA結(jié)果可得，前3個主成分分析的累積方差貢獻(xiàn)率分別達(dá)到41.87%、77.99%、85.82%，表明前3個主成分可以解釋分類信息的85.82%。樣品得分圖見圖3。可以看出，不同產(chǎn)地子芩與枯芩分別均勻分布在得分圖的兩側(cè)，具有顯著分類趨勢。表明基于PCA方法，子芩與枯芩在化學(xué)成分上具有顯著差異。

圖2 子芩和枯芩PCA得分三維投影圖

2.6.4 基于偏最小二乘-判別分析模型建立內(nèi)在差異模式和標(biāo)志物篩選

OPLS-DA作為一種有監(jiān)督的多元統(tǒng)計方法，在成分正交化的基礎(chǔ)上，最大化獲取分類樣品信息，是目前用于組間差異標(biāo)志物篩選的主要方法之一[7]。為最大程度獲取子芩與枯芩的內(nèi)在質(zhì)量差異標(biāo)志物，首先建立兩者的OPLS-DA模型，模型得分圖見圖3A，子芩與枯芩較對稱地分布在中線兩側(cè)，表明建立的模型能夠有效分類兩者的化學(xué)信息。該模型R2X、R2Y和Q2分別為0.881、0945和0.775，均大于0.5且接近1，表明模型擬合較好，所選擇的化學(xué)信息變量可以解釋94.5%的子芩與枯芩分類差異來源。為防止該模型發(fā)生過擬合造成假陽性結(jié)果，本研究通過100次交互驗證來驗證模型。從圖3B可知，該模型的交互驗證模型R2Y和Q2分別為0.957、0.831，均接近1。且所有R2Y的數(shù)據(jù)點均高于Q2，表明模型不存在過擬合現(xiàn)象，可用于標(biāo)志物的篩選。進(jìn)一步采用S-plot和VIP共同篩選差異標(biāo)志物（見圖3C、圖3D），篩選條件為（corr）＞0.5且VIP＞1，共得到3個符合條件的色譜峰，其保留時間分別為24.609、24.852、20.944 min。

2.6.5 標(biāo)志物鑒定及分析

通過與對照品進(jìn)行比對，保留時間為24.609、24.852、20.944 min的化合物分別為黃芩新素Ⅱ、千層紙素A和黃芩素（見圖4A）。經(jīng)熱點圖（圖4B）比對，發(fā)現(xiàn)這3種化合物在子芩和枯芩中含量差異較大，顯示出不同趨勢，標(biāo)志物總含量比較見圖4C?？梢钥闯觯S芩素在子芩中的含量顯著高于枯芩，而枯芩中黃芩新素Ⅱ和千層紙素A含量相對較高。

注：A.標(biāo)志物鑒定；B.熱點圖；C.標(biāo)志物總含量；1.黃芩新素Ⅱ；2.千層紙素A；3.黃芩素

3 討論

本試驗建立了測定子芩和枯芩UPLC指紋圖譜方法，得到共有峰19個，并對其中9個進(jìn)行了指認(rèn)。同時，采用化學(xué)計量學(xué)方法建立了子芩與枯芩的分類模型。結(jié)果顯示，子芩和枯芩可明顯分為兩類，表明二者成分含量存在一定差異，并篩選出3個差異標(biāo)志物，通過對照品比對鑒別出黃芩新素Ⅱ（24.609 min）、千層紙素A（24.852 min）及黃芩素（20.944 min），且3個成分在子芩與枯芩中的含量存在顯著差異。由此可見，傳統(tǒng)用藥將子芩和枯芩分開使用有一定道理，尚需進(jìn)一步研究。

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UPLC Fingerprint Study and Pattern Recognition Analysis ofPith-nodecayed andPith-decayed

SONG Yafang1, XIA Bohou2, YANG Hong1, GONG Muxin1

To establish the UPLC fingerprints ofpith-nodecayed andpith-decayed; To provide basis for identification and quality control of Scutellariae Radix.Totally 22 batches ofpith-nodecayed andpith-decayed from different habitats were analyzed using UPLC for detection, and their specific fingerprints were established; principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) were used to conduct pattern recognition research on them, and their main difference components were classified and screened. Differential components were identified by standard control method.The established UPLC fingerprints ofpith-nodecayed andpith-decayed were stable and reliable, which could evaluate their difference. 15 common peaks were obtained, and the fingerprints of samples from each habitat were highly similar. PCA cannot completely distinguishpith-nodecayed andpith-decayed, and OPLS-DA could completely distinguishpith-nodecayed andpith-decayed. There were 3 main components that caused the difference. They were identified as baicalin Ⅱ, laminar A and baicalein, and the contents of the three inpith-nodecayed andpith-decayed changed significantly.The combination of fingerprints and pattern recognition methods established in this study can distinguishpith-nodecayed andpith-decayed, which can be used as one of the effective means for quality control and evaluation of Scutellariae Radix.

Scutellariae Radix; UPLC; fingerprints; PCA; OPLS-DA

R284.1

A

1005-5304(2020)09-0092-05

10.3969/j.issn.1005-5304.202001014

國家重點研發(fā)計劃（2017YFC1701900）；首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院科研啟動基金（19qdky8）

楊紅，E-mail：yh_7108@126.com

（2020-01-02）

（2020-02-08；編輯：陳靜）