譚小寧，朱克儉，蔣益蘭，羅吉，羅燕，呂元，馬思靜，李勇敏

基于SDF-1/CXCR4信號軸研究肺復(fù)方對肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響

譚小寧，朱克儉，蔣益蘭，羅吉，羅燕，呂元，馬思靜，李勇敏

湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，中醫(yī)腫瘤學(xué)湖南省重點實驗室，抗腫瘤中藥創(chuàng)新平臺，湖南 長沙 410006

觀察肺復(fù)方對肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響，從SDF-1/CXCR4生物軸調(diào)控角度探討其作用機(jī)制。實驗分為空白血清組（正常血清培養(yǎng)基）和肺復(fù)方低、中、高劑量組（分別加入5%、10%、15%肺復(fù)方藥物血清培養(yǎng)基），各組加入基質(zhì)衍生因子1（SDF-1）處理48 h，Transwell檢測A549細(xì)胞侵襲能力，Western blot檢測A549細(xì)胞SDF-1特異受體CXCR4、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測A549細(xì)胞E-cadherin、Vimentin和CXCR4基因表達(dá)。與空白血清組比較，肺復(fù)方低、中、高劑量組A549細(xì)胞體外侵襲能力明顯下降（＜0.01）；與空白血清組比較，肺復(fù)方低、中、高劑量組A549細(xì)胞CXCR4、PI3K、Akt、p-Akt和Vimentin蛋白表達(dá)均有一定程度下降，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01），肺復(fù)方低、中、高劑量組A549細(xì)胞CXCR4、Vimentin mRNA表達(dá)下調(diào)，肺復(fù)方中、高劑量組A549細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。肺復(fù)方能抑制A549細(xì)胞侵襲能力、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，其作用機(jī)制可能與SDF-1/CXCR4生物軸調(diào)控PI3K-Akt通路有關(guān)。

肺癌；肺復(fù)方；SDF-1/CXCR4生物軸；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；A549細(xì)胞

統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌是我國發(fā)病率、死亡率第一的癌癥[1]。非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）最為常見，約占所有肺癌的85%，NSCLC分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌3種類型，由于缺乏特征性癥狀，大部分NSCLC患者在確診時己屬中晚期，常失去手術(shù)機(jī)會[2]。肺癌轉(zhuǎn)移是致死的主要原因之一，腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞的生存場所，在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用，腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞能旁分泌大量細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞分泌趨化因子CXCL12又稱基質(zhì)衍生因子-1（SDF-1）[4]，其受體CXCR4在正常組織低表達(dá)，在肺腺癌組織高表達(dá)，高表達(dá)CXCR4肺癌患者更易發(fā)生轉(zhuǎn)移[5-6]。中醫(yī)藥能改善肺癌患者癥狀、長期穩(wěn)定腫塊、一定程度上防治肺癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，達(dá)到延長生存期的目的[7-8]。湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院經(jīng)驗方肺復(fù)方長期臨床應(yīng)用表明，其能延長肺癌患者生存期，提高患者生活質(zhì)量，減輕臨床癥狀[9-10]。本研究采用高表達(dá)CXCR4受體的肺腺癌A549細(xì)胞，從SDF-1/CXCR4生物軸調(diào)控角度探討肺復(fù)方對A549轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株

人肺癌A549細(xì)胞，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號TCHu150。

1.2 動物

雄性SD大鼠50只，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號43004700029438。動物飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，溫度22～26 ℃、相對濕度40%～70%，自由攝食飲水。

1.3 藥物

肺復(fù)方[白參（蒸兌）10 g，茯苓10 g，靈芝10 g，黃芪20 g，法半夏9 g，川貝母8 g，麥冬10 g，百合 15 g，枸杞子10 g，白芍10 g，桔梗10 g，三七粉3 g，臭牡丹20 g，半枝蓮20 g，白花蛇舌草20 g，甘草5 g]，飲片均購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房，并由制劑科按比例水煎濃縮后制成膏劑，按臨床等效劑量配制成含原藥材1.7 g/mL。

1.4 主要試劑與儀器

RPMI培養(yǎng)基（Hyclone公司，批號AD18379269），0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，批號SH30042），PBS（Hyclone公司，批號AC12557265），胎牛血清（美國Gibco公司，批號1640958），ECL發(fā)光液（Thermo，批號SF249787B），磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K，貨號20584-1-AP）、蛋白激酶B（Akt，貨號60203-2-Ig）、p-Akt（貨號66444-1-AP）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin，貨號20874-1-AP）、波形蛋白（Vimentin，貨號10366-1-AP）、CXCR4（貨號11073-1-AP）、β-actin（貨號60008-1-Ig）均購自Proteintech公司，SDF-1（美國R&D公司，350-NS-010），Transwell小室（Costar 3422，24孔，孔徑8.0 μm）cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，批號RR047A），SYBR Green PCR試劑盒（Takara公司，批號RR820A）?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（GENE公司，型號G：BOX ChemiXRQ），熒光正置顯微鏡（德國Leica公司，型號DM4000），二氧化碳孵箱（美國Thermo Fisher，型號3141型），高速離心機(jī)（盧湘儀，型號TGL-18M），微量核酸蛋白濃度分析儀（英國BioDrop公司，型號BioDrop Duo），電泳儀（美國Bio-Rad，型號powerpac），轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司，型號Mini Trans-Blot C），超凈工作臺（美國Thermo Fisher，型號Heraguard EC），熒光定量PCR儀（ROCHE，F(xiàn)AST480Ⅱ型）。

2 實驗方法

2.1 藥物血清制備

實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為空白組和給藥組。給藥組給予肺復(fù)方膏劑10 mL/kg灌胃，按臨床等效劑量2倍，每日2次，連續(xù)3 d?？瞻捉M給予等量生理鹽水灌胃。末次給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，靜置，3500 r/min離心10 min，取上清液，56 ℃滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時以生理鹽水制備正常大鼠血清作對照。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

A549細(xì)胞用含10%FBS RPMI培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期A549細(xì)胞，實驗分為空白血清組（正常血清培養(yǎng)基）和肺復(fù)方低、中、高劑量組（分別加入5%、10%、15%肺復(fù)方藥物血清培養(yǎng)基），用大鼠正常血清配制成15%血清培養(yǎng)體系，每組加100 ng/mL SDF-1處理48 h。

2.3 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

Matrigel與無血清培養(yǎng)基按1∶2稀釋后每個小室鋪膠60 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)60 min使膠凝固，制備Transwell小室，然后每個小室加70 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37 ℃、30 min水化基底膜。將A549細(xì)胞用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含5 g/L BSA）制成A549細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，吸取100 μL加至小室上室內(nèi)，下室加入含10%FBS完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，用濕棉簽擦盡上室面Matrigel和細(xì)胞，甲醇固定30 min，用0.5%結(jié)晶紫染色5 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 Western blot檢測CXCR4、PI3K、p-Akt、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

收集A549細(xì)胞，加200 μL RIPA裂解液和1%PMSF提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量后上樣SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉60 min，剪取對應(yīng)蛋白條帶，分別加入CXCR4（兔抗，稀釋比1∶1000）、PI3K（兔抗，稀釋比1∶1000）、p-Akt（兔抗，稀釋比1∶1000）、E-cadherin（兔抗，稀釋比1∶1000）、Vimentin（兔抗，稀釋比1∶2000）和β-actin（鼠抗，稀釋比1∶2500）一抗，4 ℃過夜，TBS-T沖洗3次×5 min，將稀釋后的二抗（用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例1∶5000，二抗兔抗與一抗兔抗，二抗鼠抗與一抗鼠抗對應(yīng)）與膜共同孵育2 h，TBS-T沖洗3次×5 min，ECL顯影。將各條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描，并以β-actin為內(nèi)參計算各組平均值。

2.5 RT-PCR檢測E-cadherin、Vimentin、CXCR4 mRNA表達(dá)

收集A549細(xì)胞，提取總RNA，BCA法測定濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、30 min，85 ℃、20 s。然后以cDNA以模板，β-actin為內(nèi)參基因，SYBR Green PCR試劑盒擴(kuò)增E-cadherin、Vimentin和CXCR4，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性5 s，59 ℃退火30 s，共45個循環(huán)。每組設(shè)置3個復(fù)孔，用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量?；蛞镄蛄幸姳?。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

表1 PCR各基因引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長度/bp E-cadherinF：CTACAACGCTGCCATCGCCTA267 R：ACTTGACCCTGATACGTGCTT VimentinF：GTCCACACGCACCTACAGTCT 159 R：AAGTCCACCGAGTCTTGAAGC CXCR4F：TCTGTGACCGCCTTTACCC269 R：ACATCCTTGCTTGATGACCC β-actinF：ACCCTGAAGTACCCCATCGAG224 R：AGCACAGCCTGGATAGCAAC

4 結(jié)果

4.1 肺復(fù)方對A549細(xì)胞侵襲能力的影響

采用鋪有人工基底膜Matrigel的Transwell小室，模擬腫瘤細(xì)胞穿過血管基底膜的過程，用穿膜細(xì)胞多少反映腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力。與空白血清組比較，肺復(fù)方低、中、高劑量組A549細(xì)胞侵襲數(shù)顯著下降（＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組A549細(xì)胞侵襲能力比較（±s，個）

注：與空白血清組比較，**＜0.01

4.2 肺復(fù)方對A549細(xì)胞CXCR4、E-cadherin、Vimentin、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響

與空白血清組比較，肺復(fù)方低、中、高劑量組A549細(xì)胞CXCR4、Vimentin、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)均一定程度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（＜0.01）。結(jié)果見圖1、表3。

注：1.空白血清組；2.肺復(fù)方低劑量組；3.肺復(fù)方中劑量組；4.肺復(fù)方高劑量組

表3 各組A549細(xì)胞CXCR4、E-cadherin、Vimentin、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白血清組比較，*＜0.05，**＜0.01

4.3 肺復(fù)方對A549細(xì)胞CXCR4、E-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)的影響

與空白血清組比較，肺復(fù)方低、中、高劑量組A549細(xì)胞CXCR4、Vimentin mRNA表達(dá)明顯降低，（＜0.05，＜0.01），肺復(fù)方高、中劑量組A549細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.01），肺復(fù)方低劑量組A549細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)變化不明顯（＞0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組A549細(xì)胞CXCR4、E-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白血清組比較，*＜0.05，**＜0.01

5 討論

肺癌屬中醫(yī)學(xué)“肺積”“肺巖”“息賁”“虛勞”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為“肺為貯痰之器”，《太平圣惠方》“夫痰毒者，由肺臟壅熱，過飲水漿，積聚胸膈，冷熱之氣相搏，結(jié)實不消……皆由痰毒壅滯也”。蔣益蘭教授認(rèn)為肺癌發(fā)病機(jī)制為正氣先虛，邪毒乘虛而入，使肺氣閉郁，宣降失司，氣機(jī)不暢，氣滯血瘀，肺絡(luò)受阻，津液輸布不利，壅結(jié)為痰，瘀痰交阻，日久成積。本病以正虛為本，邪實為標(biāo)，虛以氣陰兩虛、脾腎虛弱最為常見，實則不外氣滯、血瘀、痰凝、毒聚。肺復(fù)方中白參、黃芪、靈芝、茯苓益氣健脾，培土生金；麥冬、百合、白芍養(yǎng)陰潤肺；川貝母、桔梗、法半夏化痰宣肺，升降相因；臭牡丹、半枝蓮、白花蛇舌草清熱解毒，軟堅散結(jié)，并制白參、黃芪、法半夏溫?zé)嶂?；腎主骨生髓，肝腎同源，枸杞子補(bǔ)益肝腎；三七活血化瘀；甘草調(diào)和諸藥。全方共達(dá)益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、化痰散瘀、軟堅散結(jié)、攻補(bǔ)兼施之功。

前期研究表明，肺復(fù)方對Lewis肺癌裸鼠移植瘤具有抑瘤作用及抗血管生成作用[11]，提示肺復(fù)方對肺癌生長轉(zhuǎn)移有一定作用。有研究顯示，腫瘤細(xì)胞大多通過與炎性細(xì)胞浸潤相似的機(jī)制參與腫瘤的進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移，細(xì)胞浸潤過程需趨化因子信號途徑調(diào)控[12-13]。CXCR4是唯一廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面的趨化因子受體，臨床上CXCR4高表達(dá)明顯促進(jìn)肺癌惡性進(jìn)展[14]，CXCR4是由352個氨基酸組成的具有跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子SDF-1與腫瘤細(xì)胞上的CXCR4結(jié)合后能激活異源三聚體G蛋白，Gβγ直接結(jié)合PI3K調(diào)節(jié)亞基以活化PI3K，通過PIP3的二級信使作用激活下游信號分子Akt，Akt磷酸化，最終通過PI3K/Akt途徑發(fā)揮促腫瘤轉(zhuǎn)移作用[15]。

研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移的一大特征，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。此過程中上皮細(xì)胞失去極性而細(xì)胞間黏附能力下降，同時獲得間質(zhì)細(xì)胞表型以及運(yùn)動和侵襲能力，表現(xiàn)為細(xì)胞表面上皮標(biāo)志物E-cadherin下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin上調(diào)。PI3K/Akt信號通路是EMT的常見通路之一，有研究證實激活的PI3K誘導(dǎo)其下游信號分子Akt磷酸化，促進(jìn)EMT[17]。

本實驗結(jié)果表明，A549細(xì)胞加入SDF-1后SDF-1/CXCR4生物軸活化，模擬肺癌微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞分泌SDF-1作用于腫瘤細(xì)胞，設(shè)置5%、10%、15%肺復(fù)方藥物血清處理A549細(xì)胞后，肺復(fù)方各劑量組較空白血清組均能下調(diào)CXCR4和PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin下調(diào)明顯，同時肺復(fù)方中、高劑量組能降低CXCR4、Vimentin的mRNA表達(dá)，升高E-cadherin 的mRNA表達(dá)?；赟DF-1/CXCR4生物軸下游信號傳導(dǎo)通路之一是PI3K-Akt信號通路，PI3K-Akt通路是影響EMT的通路之一，本研究結(jié)果表明，肺復(fù)方抑制肺癌轉(zhuǎn)移與通過下調(diào)A549 CXCR4蛋白和mRNA表達(dá)，一定程度上使SDF-1/CXCR4生物軸失活，抑制PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路活化，抑制EMT進(jìn)程有關(guān)。肺復(fù)方通過調(diào)控SDF-1/CXCR4生物軸抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移是直接還是間接通過PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路，抑制EMT進(jìn)程是否還存在其他信號通路，需要將PI3K/Akt信號通路激活或抑制后作進(jìn)一步研究。

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Effects ofon Lung Cancer A549 Cells Invasion Based on SDF-1/CXCR4 Axis

TAN Xiaoning, ZHU Kejian, JIANG Yilan, LUO Ji, LUO Yan, LYU Yuan, MA Sijing, LI Yongmin

To observe the effects ofon the invasion ability of lung cancer A549 cells; To explore the mechanism of action from the perspective of SDF-1/CXCR4 biological axis regulation.The experiment was divided into blank serum group (normal serum medium) andlow-, medium-, and high-dosage groups (adding 5%, 10% and 15%serum medium respectively). Each group was treated with matrix derived factor 1 (SDF-1) for 48 h. Transwell was used to detect the invasion ability of A549 cells. Western Blot was used to detect the expressions of SDF-1 specific receptor CXCR4, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), protein kinase B (Akt), p-Akt, E-cadherin and Vimentin in each group. The gene expression levels of E-cadherin, Vimentin and CXCR4 were detected by RT-PCR.Compared with the blank serum group, the invasion ability of A549 cells inlow-, medium- and high-dosage groups was significantly reduced (<0.01). Compared with the blank serum group, the protein expressions of CXCR4, PI3K, Akt, p-Akt and Vimentin of A549 cells in thelow-, medium- and high-dosage groups all decreased to a certain extent, and the protein expression of E-cadherin was up-regulated, with statistical significance (<0.05,<0.01); the mRNA expressions of CXCR4 and Vimentin in A549 cells were down-regulated inlow-, medium-, and high-dosage groups, while the expression of E-cadherin mRNA in A549 cells inmedium- and high-dosage groups was up-regulated, with statistical significance (<0.05,<0.01).can inhibit the invasion ability and the epithelial-mesenchymal transition process of A549 cells, and the mechanism may be related to the biological axis regulation of SDF-1/CXCR4 on PI3K/Akt pathway.

lung cancer;; SDF-1/CXCR4 biological axis; epithelial-mesenchymal transition; A549 cell

R285.5

A

1005-5304(2020)09-0058-05

10.3969/j.issn.1005-5304.202003132

國家自然科學(xué)基金（81503452、81803787）；湖南省中醫(yī)藥研究院重點項目（201804）

李勇敏，E-mail：lym0937@126.com

（2020-03-05）

（2020-03-19；編輯：華強(qiáng)）