王丹丹，王 鵬

(遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 遼寧 丹東 118003 )

益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)原名茺蔚，又名益母艾、苦草、九層樓、云母草等，隸屬于唇形科(Lamiaceae)益母草屬植物。夏季開花其味辛、微苦，性微寒，入心包、肝經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)利水的功能[1]。在世界范圍內(nèi)益母草屬植物共有23種，主要分布在亞洲、非洲及美洲各地。中國大部分地區(qū)均有分布，共計12種，2個變種，生境較廣、適應(yīng)性強。益母草是中國生藥的主要成分，種植益母草已成為部分地區(qū)主要的經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)之一，具有較大的發(fā)展前景。然而，種植者在優(yōu)良品種選育過程中，在采收母本時常常摻雜父本或其它品種，造成益母草種質(zhì)資源混亂，如同物異名、異物同名、偽品等，嚴(yán)重影響益母草的種質(zhì)純度及其真實性，為益母草的育種和種植造成損失[1]。此外，益母草雖為全國遍布種，但因各地生態(tài)環(huán)境的差異，導(dǎo)致益母草品質(zhì)有差異，尤其是其生物堿的含量，這嚴(yán)重影響益母草藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性及臨床應(yīng)用效果。當(dāng)前，制約益母種植產(chǎn)業(yè)擴大的主要問題就是雜交種的真實性和種質(zhì)純度。然而，中國目前尚未有統(tǒng)一且準(zhǔn)確可行的方案用以鑒別益母草種質(zhì)的真實性和純度[2]。同時，由于益母草栽培技術(shù)還不夠成熟，使其規(guī)范化栽培和優(yōu)良品種大面積推廣的難度增加。因此，開發(fā)益母草優(yōu)良栽培品種的選育技術(shù)勢在必行，而采用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建各地益母草DNA指紋圖譜，對其新栽培品種的選育、種質(zhì)純度的鑒定以及親緣關(guān)系鑒定等方面具有重要意義。

目前，分子標(biāo)記技術(shù)中最常用的是RAPD、AFLP、ISSR等，而EST-SSR(Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeats)分子標(biāo)記鮮見報道。EST-SSR標(biāo)記為共顯性、不含內(nèi)含子、擴增條帶易識別、且EST來自DNA編碼區(qū)，是目前鑒別種質(zhì)真實性和純度的最佳方法。此外，中國已建立多種植物指紋圖譜，如水稻、玉米品種鑒定的DNA指紋圖譜等[3-7]，而采用EST-SSR分子標(biāo)記構(gòu)建益母草DNA指紋圖譜尚未報道。本試驗采用采用益母草葉片直接進行PCR擴增，優(yōu)化了PCR反應(yīng)體系，采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)首次構(gòu)建10個不同地區(qū)益母草栽培品的DNA指紋圖譜，為益母草種品種鑒定奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗以不同地區(qū)10個常見益母草栽培種為實驗材料，分別于春季或夏季，在河北興隆、廣東新興、四川自貢、云南陸良、江蘇宿城、河南南陽、山東東營、福建龍巖、陜西渭南、安徽蚌阜等地選取數(shù)枚生長旺盛、健康、幼嫩的葉片置于含有硅膠的自封袋中保存，待用。

1.2 葉片的堿處理

將益母草葉片剪成小于2 mm2的碎片。將各品種健康幼嫩葉片分別放入Eppendorf管中，分別加入40 μL 0.25 mol/L NaOH，煮沸1 min；然后加入40 μL 0.25 mol/L的HCl和20 μL 0.5 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液，再次煮沸5 min，最后取出處理后的益母草葉片直接進行PCR擴增反應(yīng)[8-14]。

1.3 EST-SSR PCR擴增

采用EST-SSR分子標(biāo)記進行益母草多樣性分析，PCR反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 14 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.5 μL，200 U/mL Taq DNA polymerase 0.5μL，10 μmol/L上下游引物各 1 μL，cDNA模板 2 μL，最后加入經(jīng)堿處理后的益母草葉片。PCR擴增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸4 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[15-16]。PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離[17-19]，上海生工生物工程股份有限公司合成該實驗用的13對多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的核心引物(表1)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將PCR擴增的數(shù)據(jù)輸入Microsoft Excel，擴增譜帶在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳同一平行遷移位置上，有譜帶的輸入1，無譜帶的輸入0[20-21]，采用POPGENE version 1.32軟件分析觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、遺傳分化系數(shù)(FST或GST)以及基因流(Nm)(Nm=0.25(1-FST)/FST)等相關(guān)參數(shù)[22-24]，用以計算分析10個產(chǎn)區(qū)益母草栽培品種的遺傳多樣性，并計算出益母草栽培品種的生物多態(tài)信息含量PIC[25-29]；采用ClusterProject軟件構(gòu)建益母草數(shù)字指紋圖譜，采用MEGA 7.0軟件進行10份益母草栽培品的聚類分析，并計算各益母草品種間的遺傳距離差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR引物擴增

采用13對EST-SSR引物分別對10份益母草進行PCR擴增，分析多態(tài)性(圖1)。據(jù)PCR擴增數(shù)據(jù)顯示， 益母草EST-SSR引物共擴增61個等位位點，其中多態(tài)性位點高達52個，多態(tài)性比率較高(85.2%)。13對EST-SSR引物擴增2～11個等位位點，平均每對引物的基因型為4.69個，譜帶大小100～600 bp，基因流(Nm)平均值為1.319(0.190～4.295，表1)，F(xiàn)ST平均值為0.180(0.055～0.568，P<0.05，表1)；且13對EST-SSR引物的平均PIC值為0.551(0.452～0.882，表1)，微衛(wèi)星DNA變異高低程度為多態(tài)信息含量(PIC)，其數(shù)值代表微衛(wèi)星DNA多態(tài)性高低，而多態(tài)性高低取決于等位基因數(shù)目和基因頻率。說明本研究篩選出的EST-SSR引物具有較高的多態(tài)性。

2.2 EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建

不同品種的益母草，使用相同引物所擴增出的條帶具有一定的差異性，依據(jù)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳圖譜分析，數(shù)據(jù)均輸入Excel中，同一平行電泳位置上有譜帶輸入1，無條帶則輸入0，按照從小到大的順序排列擴增的譜帶，為了方便各品種益母草的譜帶對比，在相同豎排對數(shù)據(jù)進行重新排序，首先分開0和1的品種，并單獨提出此排中0或1最少的一組，然后刪除第一排電泳數(shù)據(jù)。以此類推，便可得到存在差異的各種益母草栽培品種采用不同的0或者1數(shù)字指紋圖譜的形式表示出來，相同的益母草品種其指紋數(shù)據(jù)完全相同。本文13對EST-SSR核心引物具有區(qū)別10種不同益母草品種的能力，其中篩選出5對EST-SSR引物，可完全區(qū)分10份益母草品種(表2)，并且該5對EST-SSR引物所擴增的條帶清晰、穩(wěn)定性及多樣性均較高，可用于后續(xù)遺傳多樣性分析試驗。

表2 益母草品種的DNA數(shù)字指紋圖譜

2.3 聚類分析

采用MEGA 7.0軟件進行聚類分析，構(gòu)建了10份益母草栽培品種的系統(tǒng)進化樹(圖2)。聚類分析結(jié)果與品種的來源具有較高的一致性，可見，產(chǎn)地較近的益母草品種聚在一個類群中，第Ⅰ類群有6個品種，包括河北興隆、安徽蚌埠、山東東營、江蘇宿城、河南南陽和陜西渭城；第Ⅱ類群包括2個品種，包括四川自貢和云南陸良；第Ⅲ類群有2個品種，即福建龍巖和廣東新興。

3 討論

本研究所取的10個益母草栽培品種，分布中國不同地區(qū)，即河北、安徽、山東、江蘇、河南、陜西、四川、云南、福建和廣東等地，聚類分析結(jié)果表明，在遺傳距離0.66處將所有品種分為3類，主要以益母草產(chǎn)地的距離聚類的，比如第Ⅰ類群有6個品種，包括河北興隆、安徽蚌埠、山東東營、江蘇宿城、河南南陽和陜西渭城。依據(jù)試驗數(shù)據(jù)分析，在益母草栽培種的選育過程中，導(dǎo)致各地區(qū)益母草栽培種群體內(nèi)部基因流較大的原因(Nm=1.319)，可能由于各地區(qū)在雜交選育過程中反復(fù)使用相同的授粉系或者不育系造成的，而且10份益母草栽培品種的觀測雜合度Ho(0.388)均略低于期望雜合度He(0.647)，上述原因均導(dǎo)致不同產(chǎn)地益母草性狀的相似性較高，造成同一地區(qū)益母草的遺傳基礎(chǔ)較窄。為了解決中國益母草品種遺傳基礎(chǔ)相對狹窄的情況，未來可通過遠距離引種，拓寬基因流，在育種方面加強國內(nèi)外合作，優(yōu)良品種雜交以及基因工程育種等措施來提高益母草種質(zhì)資源的優(yōu)越性。

目前，新品種的特性、品種間的差異以及于新品種的審定，一般采用DUS來鑒定。益母草新品種選育工作，只要達到文件規(guī)定條件，便可申請為益母草新品種，并未對提供的樣品進行區(qū)域試驗；而且，目前對于益母草新品種的鑒定僅局限于形態(tài)學(xué)特征，并未從基因?qū)用嫔蠈σ婺覆葸M行分子鑒定；因此，造成不同地區(qū)對同一種益母草誤稱為不同的名稱，而對不同品種益母草視為同一品種的混亂現(xiàn)象，即同物異名和異物同名。本試驗采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以在植物體的不同組織、不同發(fā)育時期進行檢測，并且不受季節(jié)、環(huán)境等因素的飾變而對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響；由于EST-SSR分子標(biāo)記不包括內(nèi)含子、在基因組中數(shù)量較大、多態(tài)性較高高、具共顯性等特點，即便在形態(tài)學(xué)上差異很小的兩個益母草品種，在遺傳基礎(chǔ)上只要存在差異，便可通過EST-SSR分子標(biāo)記進行檢測。相比較于其它分子標(biāo)記技術(shù)，EST-SSR還能夠鑒別出純合、雜合的基因型。本試驗對取于不同地區(qū)的10個益母草栽培品種，采用葉片直接PCR的方法，簡化了PCR操作過程，篩選出5對能夠鑒定10個益母草栽培品種的EST-SSR核心引物，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建出10份益母草栽培品種的DNA指紋數(shù)字圖譜；解決未來可能發(fā)生的品種糾紛問題，同時隨著益母草新品種的不斷選育，益母草指紋圖譜數(shù)據(jù)庫需不斷更新，因此便需要不斷地篩選出更多的益母草特異性EST-SSR核心引物，以此來保證中國的益母草產(chǎn)業(yè)能夠穩(wěn)定有序地健康發(fā)展。