陳誠，雷濤，沙雯君，徐碧林，陳琳，朱近悅，申甜

上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200062

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)在我國的發(fā)病率日趨增高。2 型糖尿病所導致的腎、視網(wǎng)膜、神經(jīng)及大血管病變(心臟、腦、下肢)會使患者致殘，威脅患者生命。該疾病日益成為威脅人類健康的重大疾病。有關(guān)細菌與2型糖尿病的發(fā)病機制和治療間的關(guān)系有著悠久的研究歷史，目前臨床上廣泛運用的α糖苷酶抑制劑就是從細菌(放線菌屬、鏈霉菌屬)中提取的。近年來隨著腸道菌群的研究熱潮，有關(guān)腸道菌群與肥胖、脂代謝紊亂及糖尿病等慢性代謝性疾病的研究越來越廣泛，為代謝性疾病的發(fā)生機制和治療途徑開辟了新視野[1-2]。高糖高脂飲食帶來的腸道菌群失調(diào)可能與胰島β細胞凋亡破壞[3]、胰島素抵抗[4]等密切相關(guān)。本研究通過檢測不同腸道菌群的數(shù)量變化，深入了解不同菌群(包括雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌、腸球菌等)在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色。

雙歧桿菌作為人體腸道內(nèi)重要的益生菌，既往的研究顯示腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量及活性的變化與人體物質(zhì)代謝和生理病理有著密切的關(guān)系[5]。腸道微生態(tài)平衡紊亂，尤其是腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量異常在糖尿病的發(fā)生與發(fā)展中的作用越來越受到重視。雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊是常用的微生態(tài)制劑，在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、抑制腸道病原微生物繁殖中具有一定的效果，但其對2型糖尿病患者輔助治療的作用鮮有相關(guān)報道。

本研究旨在探討雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊對腸道菌群、血糖、胰高血糖素、胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用，為微生態(tài)制劑在臨床2型糖尿病治療中的應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年10月期間就診于上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院內(nèi)分泌科且符合以下納入和排除標準的2型糖尿病患者100例，采用隨機數(shù)表法將患者分為對照組和觀察組，每組50例。觀察組中男性30例，女性20例；年齡39～70歲，平均(60.64±11.25)歲。對照組中男性26例，女性24例；年齡41～71歲，平均(61.56±12.08)歲。兩組患者的性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。納入標準：①符合1999 年世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的T2DM診斷標準；②治療依從性好的患者。排除標準：①1 型糖尿病、其他特殊類型糖尿病或妊娠糖尿??；②2 型糖尿病伴有高糖高滲狀態(tài)等急性并發(fā)癥；③伴有嚴重全身性疾病，如腫瘤、心腦血管疾病不穩(wěn)定期、肝腎等臟器嚴重損害；④近1個月服用大量抗生素、胃腸動力藥、益生元、益生菌或微生態(tài)活菌制劑等；⑤近1 個月有腹瀉或嚴重胃腸道疾病或長期便秘；⑥對治療藥物過敏。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 治療方法 兩組患者均給予藥物治療和運動治療等基礎(chǔ)治療。對照組給予口服降糖藥物或胰島素控制血糖、他汀類藥物調(diào)節(jié)血脂以及改善糖尿病并發(fā)癥等常規(guī)治療，待符合出院標準后出院繼續(xù)規(guī)律服藥治療。觀察組患者在對照組治療的基礎(chǔ)上加用雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊(規(guī)格：210 mg×24 粒，每克藥品中含有雙歧桿菌、糞腸球菌及嗜酸乳桿菌數(shù)≥1.0×107CFU)輔助治療，給予患者420 mg/次，3次/d，溫水送服，于患者出院后繼續(xù)服用8 周。囑咐患者治療8周后來院隨訪以完成治療。

1.3 觀察指標與檢測方法 (1)兩組患者治療前后的空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、空腹胰高血糖素(FGC)水平：在入院第2天以及治療8周隨訪時分別清晨空腹抽取患者肘中靜脈血5 mL，即刻置于高速離心機，3 000 r/min離心10 min，取上清液收集于清潔EP 管內(nèi)，放置-80℃冰箱保存。血液標本同批測定以下指標。采用葡萄糖氧化酶法測定FBG，放免檢測FINS，酶聯(lián)免疫吸附法測定FGC，HOMA-IR的計算公式：HOMA-IR=(FINS×FBG)/22.5。(2)兩組患者治療前后的腸道菌群數(shù)：在入院第2天以及治療8周隨訪時收集患者新鮮的清晨糞便不少于1 g置于密封的無菌糞便盒中，常溫下1 h內(nèi)快速送檢。相關(guān)檢測操作方法：取7個滅菌試管，加入9 mL的生理鹽水稀釋液待用；用天平準確稱取1 g糞便，加入9 mL試管中，充分混勻，此為10倍稀釋；用另一吸管從10-1試管吸取1 mL液體，加入10-2試管，即為100 倍稀釋，其余10-3、10-4、10-5、10-6依次類推；取一定稀釋度樣品，從高稀釋度樣品起，依次用移液器吸取0.1 mL滴入選擇培養(yǎng)皿表面，用涂布器涂勻，每個稀釋度平行滴種兩次；待樣本稀釋液完全吸收，倒置平板進行培養(yǎng)。其中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌采用厭氧培養(yǎng)法，將以上三種選擇性培養(yǎng)基放入?yún)捬鯕獯忾]，再放入37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果；腸桿菌、腸球菌采用需氧培養(yǎng)法，培養(yǎng)基直接放在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。根據(jù)菌落培養(yǎng)結(jié)果，選擇適合菌落計算的稀釋度培養(yǎng)基，算出該稀釋平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式計算細菌數(shù)：細菌數(shù)(cfu/g)=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10；結(jié)果以每克糞便質(zhì)量中菌落形成單位的對數(shù)值表示(log10 cfu/g)。

1.4 實驗器材 雙歧桿菌選擇性瓊脂、類桿菌選擇性瓊脂、乳酸桿菌選擇性瓊脂、腸球菌選擇性瓊脂、細菌培養(yǎng)皿、伊紅美蘭瓊脂、厭氧培養(yǎng)袋、厭氧產(chǎn)氣包、指示劑購自青島海博生物科技有限公司；雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊購自上海信誼藥廠有限公司；超凈工作臺購自蘇州安泰技術(shù)有限公司；高壓滅菌鍋購自日本TOMY公司；電子分析天平購自上海精密儀器儀表有限公司；高速離心機購自美國Sigma公司；熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海森系實驗儀器有限公司；超低溫冰箱購自Thermo Fisher公司；普通顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后的腸道菌群比較 治療前，兩組患者糞便樣本中的雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌、腸球菌變化比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊輔助治療8周后，觀察組患者糞便樣本中雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量較對照組升高，而擬桿菌、腸桿菌、腸球菌的數(shù)量較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 兩組患者治療前后的FBG、HBA1c、FINS、HOMA-IR、FGC比較 治療前，兩組患者的FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、FGC 比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。治療8 周后，兩組患者的FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、FGC較治療前均降低，且觀察組患者較對照組降低更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表1 兩組患者治療前后的腸道菌群比較(±s，Log10 CFU/g)

表1 兩組患者治療前后的腸道菌群比較(±s，Log10 CFU/g)

注：與對照組治療后比較，aP＜0.05。

組別觀察組對照組例數(shù)50 50時間治療前治療后t值P值治療前治療后t值P值雙歧桿菌8.15±0.63 9.82±0.56a 14.01＜0.05 8.09±0.67 8.67±0.71 4.20＜0.05乳酸桿菌8.03±0.48 8.96±0.62a 8.39＜0.05 7.96±0.50 8.24±0.68 2.35 0.02擬桿菌9.04±0.61 8.17±0.42a 8.31＜0.05 8.94±0.57 8.63±0.62 2.60 0.01腸桿菌7.85±0.65 7.26±0.39a 5.50＜0.05 7.81±0.72 7.74±0.59 0.59 0.60腸球菌7.14±0.49 6.68±0.52a 4.55＜0.05 7.21±0.63 7.05±0.56 1.34 0.18

表2 兩組患者治療前后的FBG、HBA1c、FINS、HOMA-IR、FGC比較(±s)

表2 兩組患者治療前后的FBG、HBA1c、FINS、HOMA-IR、FGC比較(±s)

注：與對照組治療后比較，aP＜0.05。

組別觀察組對照組例數(shù)50 50時間治療前治療后t值P值治療前治療后t值P值FBG(mmol/L)9.02±1.26 6.27±0.93a 8.78＜0.05 9.14±1.38 7.25±1.16 5.24＜0.05 HbA1c(%)9.16±0.76 7.24±0.52a 10.42＜0.05 9.20±0.82 7.71±0.65 7.12＜0.05 FINS(mU/L)8.14±2.89 3.58±1.30a 7.19＜0.05 8.42±3.76 5.36±3.39 3.02＜0.05 lgHOMA-IR 0.41±0.09 0.22±0.06a 8.78＜0.05 0.48±0.06 0.36±0.12 4.47＜0.05 FGC(pg/mL)129.56±12.37 87.21±14.05a 11.31＜0.05 127.33±15.64 98.72±10.28 7.64＜0.05

3 討論

隨著人類飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，T2DM 發(fā)病率逐年增高，已成為全球關(guān)注的公共健康問題，但其發(fā)病機制尚未被完全闡明。研究認為，腸道菌群參與調(diào)節(jié)人體營養(yǎng)吸收與代謝，影響機體免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌等多項生理功能，與T2DM等代謝性疾病的發(fā)病和病情進展關(guān)系密切[6]。腸道菌群紊亂可能會引起胰島素抵抗及T2DM 等代謝性疾病，其對T2DM 發(fā)病的影響可能超過遺傳因素的作用[7]。T2DM患者腸道微生態(tài)失衡，雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌數(shù)量顯著下降，厚壁菌門和梭菌綱數(shù)量明顯低于正常人，擬桿菌門/厚壁菌門的比例與血糖濃度正相關(guān)，β變形桿菌在糖尿病患者中數(shù)量明顯升高[8]。

乳酸桿菌作為腸道益生菌，可通過代謝產(chǎn)物降低腸道pH，抑制致病菌生長，減少腸源性毒素的產(chǎn)生[9]。本實驗結(jié)果與Lê等[10]對廣州地區(qū)50 例2 型糖尿病患者和30例正常人糞便腸道菌群的研究相比，雙歧桿菌的變化趨勢一致，但乳酸桿菌的變化卻相反，考慮可能是由于研究對象所處的地域環(huán)境差異造成的。此外有多種因素會影響腸道菌群的構(gòu)成，包括年齡、飲食結(jié)構(gòu)和是否服用抗生素、益生菌以及益生元等[11]。

T2DM 的發(fā)生被認為與機體長期的、持續(xù)的慢性炎癥狀態(tài)有密切關(guān)聯(lián)。雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊作為一種常用的口服生物活菌制劑，主要用于腸道菌群失調(diào)引起的腹脹和腹瀉[12]。其機制主要是膠囊進入人體后，拮抗大腸桿菌等致病菌在腸道內(nèi)定植生長，形成有益的腸道微生態(tài)環(huán)境，重建腸道內(nèi)微生物屏障，降低血清中的脂多糖水平，使機體慢性炎癥狀態(tài)得到緩解，從而有利于延緩T2DM的發(fā)生發(fā)展。既往的研究表明雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊能使三種益生菌通過腸溶膠囊順利進入結(jié)腸，在腸道環(huán)境中生長，產(chǎn)生作用持久的聯(lián)合益生菌菌群，從而調(diào)節(jié)糖脂能量代謝，達到提高胰島素敏感性和葡萄糖耐量性的目的[13]。研究結(jié)果顯示，T2DM 患者在服用雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊后，雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量較對照組升高，而擬桿菌、腸桿菌與腸球菌數(shù)量相對下降，提示雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊對腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用。雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊可以有效調(diào)節(jié)腸道菌群，提高益生菌數(shù)量，恢復完整的腸道屏障功能，進一步改善腸道上皮通透性，有效抑制條件致病菌群的移位，使產(chǎn)脂多糖的革蘭氏陰性桿菌維持在較低水平，從而減少代謝性內(nèi)毒素血癥和低度炎癥反應[14]。此外，本實驗研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊可以抑制胰高血糖素的釋放，其機制可能是雙歧桿菌提高T2DM患者腸道GLP-1 的表達，GLP-1 水平升高進而抑制胰島α細胞釋放胰高血糖素，從而改善糖代謝。

改善胰島素抵抗對T2DM 及并發(fā)癥的治療均有重要意義。本實驗研究表明雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊治療后的T2DM患者血糖與胰島素抵抗指數(shù)降低，說明雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊可以在一定程度上改善胰島功能。有相關(guān)研究認為，雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊能增加胰島細胞Bel-2表達，下調(diào)胰島細胞Bax表達，保護胰島β細胞，避免凋亡發(fā)生，降低胰島內(nèi)炎癥反應，減輕胰島的損傷程度[15]。與胰島素促泌劑等藥物不同，雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊能有效緩解機體高胰島素血癥，對胰島β細胞起到保護作用。

本研究結(jié)果顯示，雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊輔助治療8 周后，觀察組T2DM 患者較對照組的FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、FGC均有所降低，說明雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊通過改善患者腸道內(nèi)菌群紊亂情況，可起到改善胰島素抵抗、降低T2DM 患者血清中胰高血糖素水平、糾正機體糖代謝紊亂的作用。HOLST等[16]研究認為，雙歧桿菌可刺激腸道L細胞分泌胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，抑制胰島α細胞釋放胰高血糖素，同時GLP-1 可促進胰島β細胞的增殖和再生，抑制胰島β細胞的凋亡，與本試驗研究結(jié)果相符。

本研究中50 例T2DM 患者口服雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊共8 周，經(jīng)相關(guān)實驗室檢測發(fā)現(xiàn)該藥輔助治療T2DM 可以顯著增加腸道菌群中雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量，減少腸道內(nèi)擬桿菌、腸桿菌、腸球菌的數(shù)量，并有效改善糖尿病患者胰島β細胞功能。機體對胰島素的敏感性進一步提高，胰島素抵抗得以改善，同時雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊能減少胰高血糖素的釋放，從而有利于維持患者的血糖穩(wěn)定。在口服雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊輔助治療期間，患者未見明顯不良反應及過敏情況，無惡心、腹脹及腹瀉的發(fā)生，無皮疹、藥物熱及肝腎功異常，臨床應用過程中也沒有發(fā)生低血糖事件。本研究為雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊臨床輔助治療T2DM提供一定的依據(jù)，但本研究只檢測了幾種代表性菌群的變化，且實驗對象人數(shù)較少，研究結(jié)果尚有局限性。下一步研究將應用高通量測序技術(shù)獲得有關(guān)腸道菌群更準確、更可靠的研究數(shù)據(jù)和實驗結(jié)論，以求更為全面地了解腸道菌群的改變在T2DM發(fā)展進程中的影響以及雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊參與輔助治療給T2DM患者帶來的獲益，為雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊在臨床上輔助治療T2DM提供參考依據(jù)。