梁建琴 白雪娟 王金河 陳志 郭東霖 吳雪瓊

WHO[1]《2019年全球結(jié)核病報(bào)告》估算，2018年我國(guó)新發(fā)結(jié)核病患者例數(shù)接近86.6萬(wàn)例，3.88萬(wàn)例死于結(jié)核病。我國(guó)糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者快速增加，糖尿病并發(fā)肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)高達(dá)22%，居結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之首，并有逐年上升趨勢(shì)，對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅[2]。

DM患者容易罹患結(jié)核病，除了與感染的結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量和毒力以及DM患者的代謝狀態(tài)有關(guān)外，是否與免疫功能變化有關(guān)，是近年來(lái)關(guān)注的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道高血糖或胰島功能下降直接或間接影響巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞功能[3]?？偨Y(jié)分析肺結(jié)核并發(fā)糖尿病(PTB-DM)患者的臨床特征及患者外周血淋巴細(xì)胞亞群水平，對(duì)了解DM患者PTB發(fā)病機(jī)制、演變、預(yù)后及指導(dǎo)臨床免疫治療有重要意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

對(duì)象和方法

一、 研究對(duì)象

回顧性收集2018年4月1日至2019年5月31日在解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心結(jié)核二科住院的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的肺結(jié)核患者181例，年齡14～89歲，中位年齡47歲。根據(jù)是否并發(fā)DM將其分為兩組：PTB-DM組85例，年齡20～86歲，中位年齡55歲；單純PTB(以下稱PTB組)96例，年齡15～76歲，中位年齡32歲。

二、 納入標(biāo)準(zhǔn)

DM診斷符合 2019年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。 PTB診斷符合中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)頒布的《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[5]。PTB初治、復(fù)治定義符合《WS 196—2017結(jié)核病分類》[6]。

三、 排除標(biāo)準(zhǔn)

兩組患者排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)精神分裂患者；(2)惡性腫瘤患者(包括白血病)；(3)器官移植包括干細(xì)胞移植患者；(4)伴有自身免疫疾病患者；(5)HIV感染或艾滋病(AIDS)患者；(6)并發(fā)支氣管哮喘和正在使用糖皮質(zhì)激素的患者；(7)并發(fā)曲霉菌感染患者；(8)嚴(yán)重心肝、腎功能障礙或衰竭患者；(9)妊娠和哺乳期婦女；(10)重度營(yíng)養(yǎng)不良患者。

四、研究方法

1.淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)方法及15個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目：采用美國(guó)BD公司FACS流式細(xì)胞儀、試劑和數(shù)據(jù)分析軟件Diva，按照說(shuō)明書檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群，包括15個(gè)項(xiàng)目：總T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)百分比、NK樣T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+、雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞百分比、雙陰性T淋巴細(xì)胞百分比、總B淋巴細(xì)胞百分比、總T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、NK樣T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、總B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。

2.結(jié)核分枝桿菌特異性反應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)方法及結(jié)果判讀：標(biāo)本采集、檢測(cè)方法及結(jié)果判讀均按照上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司“結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法)”使用說(shuō)明書實(shí)施，斑點(diǎn)數(shù)<15個(gè)為陰性，≥15個(gè)為陽(yáng)性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)兩組患者的性別、年齡、治療史、胸部CT掃描征象和結(jié)核分枝桿菌特異性反應(yīng)T細(xì)胞計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)兩組15項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的比較，先采用Kolmogorov-Smirnovhe Shapiro-Wilk進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；符合偏態(tài)分布，采用“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]”表示，采用兩獨(dú)立樣本比較的非參數(shù)Z檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 臨床特征

對(duì)兩組研究對(duì)象進(jìn)行性別、年齡、治療史、是否有空洞和病變范圍等臨床特征進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，兩組患者均為男性多于女性，但PTB-DM組男性明顯占優(yōu)勢(shì)，PTB組女性明顯多于PTB-DM組(χ2=7.42，P=0.006)；兩組患者年齡多集中在25～60歲，PTB組<25歲的患者明顯多于PTB-DM組，>60歲的患者明顯少于PTB-DM組(χ2=23.55，P=0.000)。在<25歲的PTB-DM組有2例 1型DM，1例20歲，1例21歲，均為女性患者；PTB-DM組初治和復(fù)治患者分別占74.1%(63/85)和25.9%(22/85)，PTB組分別占84.4%(81/96)和15.6%(15/96)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.92，P=0.088)。PTB-DM組胸部CT掃描顯示有空洞和病變范圍≥3個(gè)肺葉的患者明顯多于PTB組(χ2=16.56，P=0.000；χ2=9.20，P=0.002)。見(jiàn)表1。

二、 淋巴細(xì)胞亞群

對(duì)85例PTB-DM患者和96例PTB患者外周血6項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但6項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)結(jié)果的中位數(shù)值的趨勢(shì)顯示PTB-DM組均低于PTB組。以總T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)和總B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的中位數(shù)值降低明顯。見(jiàn)表2。

三、 結(jié)核分枝桿菌特異性反應(yīng)T細(xì)胞

96例PTB組中，7例未檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性反應(yīng)T細(xì)胞，其余89例中，結(jié)果陽(yáng)性66例(74.2%)，陰性23例(25.8%)；85例PTB-DM組中，5例未檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性反應(yīng)T細(xì)胞，其余80例中，結(jié)果陽(yáng)性65例(81.3%)，陰性15例(18.8%)；差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.22，P=0.270)。

討 論

DM和PTB是臨床常見(jiàn)病, 在患者中兩者常并存并且密切關(guān)聯(lián)，相互影響[2]。DM患者PTB的患病率高出正常人的3倍以上[7-8]。目前普遍認(rèn)為，DM患者的高血糖可作為結(jié)核分枝桿菌良好的培養(yǎng)基、肺部微血管病變可導(dǎo)致血氧交換受累使得局部微環(huán)境呈酸性，以及DM所致糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝紊亂，均有利于結(jié)核分枝桿菌定植、生長(zhǎng)和繁殖[9]。另外，董斯佳等[10]的研究結(jié)果顯示，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10的1082位點(diǎn)AA基因型和C-A單倍型與DM并發(fā)PTB易感性有關(guān)。但高血糖是否導(dǎo)致免疫功能受損使陳舊性結(jié)核病或潛伏性結(jié)核感染再激活導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)病尚不清楚[7]。

表1 PTB-DM和PTB兩組研究對(duì)象臨床特征比較

表2 淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果在兩組研究對(duì)象中的比較

本研究首先對(duì)85例PTB-DM和96例PTB患者進(jìn)行了年齡、性別、治療史和肺部CT特征的分析比較，結(jié)果提示PTB-DM組的復(fù)治患者多于PTB組，提示DM可能是影響PTB復(fù)發(fā)和難治的原因之一，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。而兩組患者在性別、年齡、胸部CT掃描有無(wú)空洞和病變范圍比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PTB-DM多發(fā)生在中老年男性，25歲以下PTB-DM在該研究中只有2例，都是1型DM。因此，應(yīng)注重對(duì)中老年男性PTB患者進(jìn)行血糖篩查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)DM，有利于抗結(jié)核藥品治療方案的調(diào)整和預(yù)后評(píng)估。本研究顯示，PTB-DM的胸部CT掃描特征同以往的研究[11-13]一樣，空洞的發(fā)生率及病變范圍大于3個(gè)肺葉的患者，其發(fā)生率明顯高于單純的PTB患者。反映了PTB-DM患者病情較PTB患者病情嚴(yán)重，傳染性強(qiáng)，對(duì)社會(huì)及家庭危害較大，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)PTB患者血糖監(jiān)測(cè)，以及在DM患者中行PTB的快速篩查。

外周血T細(xì)胞中95%左右為T細(xì)胞受體(TCR)α/β肽鏈T細(xì)胞，是參與特異性細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞。而CD4-CD8-雙陰性細(xì)胞多數(shù)為TCRγ/δ肽鏈 T細(xì)胞，只占外周血T細(xì)胞的2%～7%，主要分布于皮膚和黏膜，可識(shí)別多種病原體表達(dá)的共同抗原成分(非肽類分子)，無(wú)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)限制性。主要功能是抗感染、抗腫瘤、殺傷受感染的靶細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。研究表明[14]，雙陰性T淋巴細(xì)胞表面Toll樣受體是天然免疫的重要調(diào)節(jié)器，其介導(dǎo)的活化信號(hào)在適應(yīng)性免疫起始階段可能起輔助作用。另外，結(jié)核分枝桿菌感染后，CD4-CD8-雙陰性TCRγ/δ肽鏈 T細(xì)胞能快速產(chǎn)生IL-17，通過(guò)上調(diào)炎癥因子和招募中心粒細(xì)胞、單核細(xì)胞趨化等發(fā)揮促炎作用，還可協(xié)同活化T細(xì)胞，連接先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。有文獻(xiàn)報(bào)道，DM患者對(duì)結(jié)核分枝桿菌天然免疫應(yīng)答受損，隨后出現(xiàn)超反應(yīng)性適應(yīng)性免疫應(yīng)答。其中NK細(xì)胞和Treg細(xì)胞以及產(chǎn)生的細(xì)胞因子γ干擾素 (IFN-γ)、 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素家族成員等起了關(guān)鍵性作用[15-17]。本研究對(duì)85例PTB-DM和96例PTB患者進(jìn)行了6項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)的比較分析，結(jié)果提示兩組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但從表2結(jié)果可以看出， PTB-DM組6項(xiàng)淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)中位數(shù)值均低于PTB組，尤其是總T和總B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)降低較明顯，差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但總體趨勢(shì)提示PTB-DM組的免疫功能還是有所降低。需要加大樣本量，進(jìn)一步開展前瞻性病例對(duì)照研究證實(shí)。

另外，雙陰性T淋巴細(xì)胞具有免疫抑制功能并能誘導(dǎo)耐受，抑制CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞功能以預(yù)防體內(nèi)過(guò)度亢進(jìn)的細(xì)胞免疫應(yīng)答所造成的免疫損傷?；顒?dòng)性PTB患者雙陰性T淋巴細(xì)胞減少使機(jī)體免疫抑制功能降低，以提高結(jié)核分枝桿菌清除能力[14]。本研究沒(méi)有檢測(cè)雙陰性T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)，將是下一步研究的方向。

本研究檢測(cè)的淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與石文卉等[18]報(bào)道一致，與Kumar 和Babu[7]和陸恩詞和朱穎蔚[9]報(bào)道不一致。分析原因：一方面可能因?yàn)楸狙芯繘](méi)有設(shè)單純DM對(duì)照、缺少治療前后的比較，存在一定的局限性和偏倚；更重要一方面因?yàn)榻Y(jié)核病免疫錯(cuò)綜復(fù)雜，影響因素較多，檢測(cè)結(jié)果不僅與病變特征、治療經(jīng)過(guò)有關(guān)聯(lián)，還與研究對(duì)象納入及排除標(biāo)準(zhǔn)是否嚴(yán)格有密切關(guān)系。本研究?jī)山M患者排除標(biāo)準(zhǔn)限定嚴(yán)格，除了結(jié)核病和DM外，盡可能排除影響免疫功能的其他并發(fā)疾病，可能是與其他研究結(jié)果不一致的原因之一。

雖然兩組患者淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是PTB組的所有6項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)值，包括總T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、NK樣T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、總B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均高于PTB-DM組，說(shuō)明PTB-DM較PTB患者無(wú)論細(xì)胞免疫還是體液免疫均受到一定程度抑制，提示對(duì)PTB-DM患者在治療上應(yīng)加強(qiáng)免疫支持。下一步將擴(kuò)大樣本量，嚴(yán)格研究設(shè)計(jì)，對(duì)DM的分型及病程等進(jìn)行分層分析，檢測(cè)多種細(xì)胞因子，進(jìn)一步明確DM與免疫水平之間的關(guān)系，得出更加科學(xué)的、有指導(dǎo)意義的結(jié)論用于指導(dǎo)臨床。

γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)是近年來(lái)結(jié)核病免疫學(xué)診斷的重要技術(shù)，可檢測(cè)患者外周血IFN-γ水平的變化來(lái)判斷有無(wú)結(jié)核感染；本研究采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)技術(shù)檢測(cè)外周血結(jié)核分枝桿菌特異性反應(yīng)T細(xì)胞。雖然IGRA是一項(xiàng)診斷技術(shù)，不能作為判斷病情輕重和預(yù)后的指標(biāo)，但為了了解DM是否影響PTB患者外周血T淋巴細(xì)胞的致敏和活化，抑制干擾素的產(chǎn)生與釋放，本研究對(duì)89例PTB和80例PTB-DM患者的外周血結(jié)核特異性反應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

DM與結(jié)核病的密切關(guān)系，以及兩者的相互作用已經(jīng)成為臨床和基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)問(wèn)題。結(jié)核病的嚴(yán)重程度增加了患DM的風(fēng)險(xiǎn)，DM控制不理想將嚴(yán)重影響PTB的療效及轉(zhuǎn)歸，已構(gòu)成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[19]。更深入研究DM患者結(jié)核病易感性的免疫機(jī)制，有助于制定合理的治療策略，減輕社會(huì)和患者的雙重負(fù)擔(dān)。