李婷婷 劉歡慶 杜巧盈

隨著醫(yī)藥技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，我國(guó)結(jié)核病發(fā)病率有所控制。目前，肺結(jié)核的治療主要以化學(xué)藥品為主，但長(zhǎng)期應(yīng)用西藥治療會(huì)產(chǎn)生較大的藥物不良反應(yīng)，同時(shí)也容易出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象。中醫(yī)藥輔助治療肺結(jié)核能明顯改善患者臨床癥狀[1-2]，提高痰菌陰轉(zhuǎn)率[3]。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)經(jīng)過(guò)上千年的積累，已經(jīng)保留了不少治療肺結(jié)核的經(jīng)典方劑，如肺腑湯、保真湯等，李志明等[4]自擬的柴竹石膏湯治療反復(fù)發(fā)熱結(jié)核病并發(fā)其他感染患者具有較好臨床療效，可見(jiàn)，中藥湯劑治療結(jié)核病有著重要的作用。文本挖掘(text ming)能夠整合海量的中醫(yī)藥文獻(xiàn)，從文本數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)并提取用戶(hù)所需的關(guān)鍵信息。在多種多樣的分析工具中，Rapidminer是最有潛力進(jìn)行可伸縮大數(shù)據(jù)分析的平臺(tái)[5]。因此，筆者采用Rapidminer 分析技術(shù)對(duì)中藥治療肺結(jié)核的文獻(xiàn)進(jìn)行分析，探索肺結(jié)核的中醫(yī)臨床用藥規(guī)律，同時(shí)通過(guò)中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)在線分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)[6]、TTD、DisGeNET 和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)和篩選核心中藥治療肺結(jié)核的作用靶點(diǎn)，并用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物功能及KEGG通路分析。

資料和方法

1.文獻(xiàn)檢索：通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)和萬(wàn)方醫(yī)學(xué)網(wǎng)檢索中文文獻(xiàn)，檢索詞為“肺結(jié)核”“中藥”；通過(guò)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)檢索外文文獻(xiàn)，檢索詞為“tuberculosis”“traditional Chinese medicine”； 檢索時(shí)間限定為1998年1月1日至2018年12月31日。共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)512篇(中文文獻(xiàn)405篇，外文文獻(xiàn)107篇)，最終納入363篇(中文文獻(xiàn)352篇，外文文獻(xiàn)11篇)。

2.納入排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：中藥復(fù)方治療肺結(jié)核的臨床研究文獻(xiàn)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①僅以摘要形式發(fā)表的文獻(xiàn)；②綜述性文獻(xiàn)；③只有診斷或鑒別診斷的文獻(xiàn)；④動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)。

3.中藥名詞術(shù)語(yǔ)：參照《中藥學(xué)》[7]，中藥根據(jù)功效分為解表藥、清熱藥、瀉下藥、祛風(fēng)濕藥、化濕藥、利水滲濕藥、溫里藥、理氣藥、消食藥、驅(qū)蟲(chóng)藥、止血藥、活血化瘀藥、化痰止咳平喘藥、安神藥、平肝息風(fēng)藥、開(kāi)竅藥、補(bǔ)虛藥、收澀藥、涌吐藥、攻毒殺蟲(chóng)止癢藥、拔毒化腐生肌藥等共21類(lèi)。同時(shí)，根據(jù)《中藥學(xué)》規(guī)范文獻(xiàn)中藥物名稱(chēng)，如元胡、玄胡歸為延胡索。

4.文本挖掘分析：將下載的文獻(xiàn)轉(zhuǎn)化為“.txt格式”并以ANSI格式保存。應(yīng)用Rapidminer軟件對(duì)下載的文獻(xiàn)對(duì)照關(guān)鍵詞庫(kù)進(jìn)行信息提取，并按統(tǒng)一格式保存為便于Access數(shù)據(jù)庫(kù)和SQL大型數(shù)據(jù)庫(kù)處理的格式，基于頻繁模式樹(shù)(FP-growth)算法，對(duì)治療肺結(jié)核的中藥進(jìn)行一維頻次的分析和二維關(guān)系分析。利用Cytoscape 3.7軟件對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，形成二維關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖。 應(yīng)用BATMAN-TCM對(duì)高頻中藥進(jìn)行生物信息學(xué)分析。運(yùn)用治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)[TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)、 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)]搜索獲得結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)。將核心中藥抗結(jié)核的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋工具中(https://david. ncifcrf.gov/，Version 6.8)進(jìn)行GO(gene ontology)分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析。

結(jié) 果

1.各類(lèi)中藥使用情況：對(duì)363篇文獻(xiàn)中所涉及到的出現(xiàn)頻次≥10的中藥進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，治療肺結(jié)核使用頻次最高的是補(bǔ)虛藥(663次)，其次為活血化瘀藥(403次)、清熱藥(325次)及化痰止咳平喘藥(282次)。

2.藥物使用情況： 363篇文獻(xiàn)中包含122味中藥，使用總頻次為2470次；使用頻次≥10的中藥共72味，使用頻次排名前5位的中藥為甘草(122次)、當(dāng)歸(102次)、生地(99次)、白芍(74次)、百部(72次)。

3.藥對(duì)使用情況：將363篇文獻(xiàn)進(jìn)行藥物兩兩聯(lián)用組合的分析，將最小支持度設(shè)置為0.028，即A藥與B藥在分析文獻(xiàn)中同時(shí)出現(xiàn)的概率≥2.8%。結(jié)果顯示，兩兩藥對(duì)出現(xiàn)頻次最高的是甘草-當(dāng)歸(70次)，其次為甘草-生地(52次)，當(dāng)歸-生地(49次)，當(dāng)歸-白芍(49次)。

進(jìn)一步分析中藥聯(lián)用情況，3味藥組合出現(xiàn)頻次較高的有甘草-當(dāng)歸-生地(37次)、甘草-當(dāng)歸-柴胡(31次)及甘草-當(dāng)歸-黨參(31次)，4味藥組合出現(xiàn)頻次最高的是甘草-當(dāng)歸-生地-白芍(24次)。

4.用藥規(guī)律：將最小置信度設(shè)置為0.6，即A藥出現(xiàn)后B藥出現(xiàn)的概率≥60%。生地、白芍配伍時(shí)當(dāng)歸也出現(xiàn)的概率為95.0%；黨參、白芍配伍時(shí)當(dāng)歸也出現(xiàn)的概率為94.7%，丹參、白芍配伍時(shí)當(dāng)歸也出現(xiàn)的概率為94.7%(表1)。

表1 中藥治療肺結(jié)核的用藥規(guī)律文本分析結(jié)果

5.藥物聯(lián)用情況：選取支持度≥0.028的藥物聯(lián)用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7可視化軟件，顯示治療肺結(jié)核的藥物聯(lián)用情況如圖1所示。圖中節(jié)點(diǎn)代表中藥，節(jié)點(diǎn)的大小代表該藥物與其他藥物聯(lián)用得出的藥物權(quán)重，權(quán)重越大節(jié)點(diǎn)越大；兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的連線代表中藥之間的聯(lián)用情況。由圖1可見(jiàn)，與其他藥物聯(lián)用時(shí)甘草的用藥權(quán)重最高(3.32%)，其次為當(dāng)歸(3.25%)、生地(1.94%)、白芍(1.88%)，可作為中醫(yī)治療肺結(jié)核的核心藥物，與其他多種藥物具有廣泛的聯(lián)用關(guān)系。

6.核心治療中藥分子靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：選取核心藥物甘草、當(dāng)歸、生地和白芍，應(yīng)用BATMAM-TCM在線分析工具，將“cut-off”值設(shè)為80，“AdjustPvalue(校正P值)”設(shè)為0.05。結(jié)果顯示，4味藥物共包括385種已知化合物，將277種結(jié)構(gòu)明確、靶點(diǎn)已知的化合物納入分析，剔除各化合物重復(fù)靶點(diǎn)后獲得作用靶點(diǎn)共430個(gè)。通過(guò)TTD、DisGeNET、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)鍵詞檢索，共收集到2482個(gè)結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)，然后將整理的結(jié)核疾病靶標(biāo)與核心藥物有效成分靶點(diǎn)映射篩選出共同靶點(diǎn)92個(gè)，見(jiàn)表2。對(duì)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析(圖2)，結(jié)果顯示核心中藥治療肺結(jié)核的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集的生物學(xué)過(guò)程為：氧化還原(21個(gè)基因)、細(xì)胞死亡(20個(gè)基因)、細(xì)胞程序性死亡(20個(gè)基因)、細(xì)胞凋亡(20個(gè)基因)。KEGG通路富集分析見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示4味核心中藥抗結(jié)核的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集的通路為：癌癥通路(14個(gè)基因)、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移(13個(gè)基因)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(10個(gè)基因)、ErbB信號(hào)通路(10個(gè)基因)等。表明4味核心中藥活性成分的關(guān)鍵靶點(diǎn)分布于不同的通路，可通過(guò)各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗結(jié)核作用。這些通路可作為未來(lái)研究核心中藥抗結(jié)核機(jī)制的重要方向。

討 論

文本挖掘已經(jīng)在多個(gè)行業(yè)領(lǐng)域如教育、商業(yè)、生物技術(shù)等中發(fā)揮重要的作用[8]。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的文章數(shù)量呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)的增長(zhǎng)，但是人們對(duì)信息的處理及分析遠(yuǎn)滯后于醫(yī)學(xué)信息的增長(zhǎng)，因此，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域文本挖掘的開(kāi)展刻不容緩。中醫(yī)藥有著幾千年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)積累了大量的信息數(shù)據(jù)。近幾年，文本挖掘技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其是中醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，為分析中醫(yī)證候、配伍規(guī)律提供了有力的信息技術(shù)支撐[9-10]。筆者利用Rapidminer分析軟件對(duì)大量的關(guān)于中醫(yī)藥治療肺結(jié)核文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)治療肺結(jié)核的藥物主要為補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥和清熱藥。王勝圣等[11]調(diào)查發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核的癥候主要為肺陰虧虛、陰虛火旺、氣陰兩虛，因此，用清熱藥除蒸，用補(bǔ)虛藥補(bǔ)氣治本，而使用化痰止咳平喘藥屬對(duì)癥治療，與本文的分析結(jié)果一致。補(bǔ)虛藥又分為補(bǔ)氣藥、補(bǔ)血藥、補(bǔ)陰藥和補(bǔ)陽(yáng)藥。補(bǔ)氣藥可補(bǔ)脾益氣，補(bǔ)陰藥可補(bǔ)充因長(zhǎng)期消耗和虛熱減為匱乏的陰液，而補(bǔ)血藥則可填補(bǔ)精血，補(bǔ)益肺腎。而肺結(jié)核發(fā)病部位在肺部，且為慢性疾病，患者多為腎陰不足，精血不充，因此，需以補(bǔ)虛藥治療肺結(jié)核的陰血虧虛。有學(xué)者認(rèn)為肺結(jié)核兼有血瘀的癥狀，通過(guò)滋陰殺蟲(chóng)，活血化瘀治療肺結(jié)核血瘀陰虛型患者取得了較好的療效[12]。伍明俊[13]應(yīng)用人參、黃芪、麥冬、丹參、川芎等配伍的扶正湯對(duì)肺結(jié)核患者肝功能異常、末梢神經(jīng)炎有較好的療效。筆者通過(guò)文本挖掘分析發(fā)現(xiàn)，丹參為治療肺結(jié)核常用的活血化瘀藥，也證實(shí)了活血化瘀藥在治療肺結(jié)核中的作用。使用頻次居第三者為清熱藥，肺結(jié)核的主要癥狀之一的骨蒸潮熱便是由肺腎陰虛引起，陰虛則陽(yáng)偏亢。明代龔居中編著的《紅爐點(diǎn)雪》[14]中有云：夫癆者勞也，以勞傷精氣血液，遂致陽(yáng)盛陰虧，火炎痰聚。因此配伍清熱藥瀉火退潮熱，以治療肺結(jié)核的骨蒸潮熱。結(jié)核病患者脾肺氣虛，津液運(yùn)化不利，易生痰濕，犯于肺則咳嗽咳痰；因此，治療肺結(jié)核時(shí)也常配伍止咳化痰藥。

圖中節(jié)點(diǎn)代表中藥，節(jié)點(diǎn)的大小代表該藥物與其他藥物聯(lián)用得出的藥物權(quán)重，權(quán)重越大節(jié)點(diǎn)越大；兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的連線代表中藥之間的聯(lián)用情況圖1 中藥治療肺結(jié)核的藥物二維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表2 核心中藥治療肺結(jié)核的部分分子靶點(diǎn)信息

圖2 甘草、當(dāng)歸、生地、白芍等核心中藥治療肺結(jié)核關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集分析

圖3 甘草、當(dāng)歸、生地、白芍等核心中藥治療肺結(jié)核關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

通過(guò)文本挖掘發(fā)現(xiàn)，甘草使用頻次最高，其次為當(dāng)歸、生地。黃潔和周建英[15]使用生甘草聯(lián)合西醫(yī)抗結(jié)核藥品治療繼發(fā)性肺結(jié)核痰菌陽(yáng)性患者發(fā)現(xiàn)，相較于僅用抗結(jié)核西藥治療的患者能明顯改善患者的體質(zhì)量指數(shù)和肺部病變吸收情況。綜合分析，甘草之所以是最高頻次使用藥物，主要原因有三，一是甘草素有“國(guó)老”之稱(chēng)，能夠緩和峻烈藥物的毒性，二是入心肺脾經(jīng)補(bǔ)心脾氣，三是具有祛痰止咳的功效。當(dāng)歸性甘溫，歸肝心脾經(jīng)，可補(bǔ)血亦可活血，在補(bǔ)血養(yǎng)陰的基礎(chǔ)上行活血祛瘀之功。一般肺結(jié)核會(huì)伴有咯血的癥狀，使用當(dāng)歸補(bǔ)血的特性改善咯血的癥狀；對(duì)于血瘀陰虛行患者配伍當(dāng)歸則可使血瘀去，新血生。當(dāng)歸的有效成分當(dāng)歸多糖和阿魏酸是補(bǔ)血的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸多糖和阿魏酸可增加血虛動(dòng)物骨髓造血細(xì)胞的總量[16]。同時(shí)，也有研究顯示當(dāng)歸可明顯改善血瘀大鼠的血液流變學(xué)和凝血功能異常[17]。生地歸心、肝、腎經(jīng)，有清熱涼血、養(yǎng)陰之功。《本草秘錄》[18]中提到生地可涼血補(bǔ)血，涼中有補(bǔ)，遏制血的上炎之勢(shì)。肺結(jié)核的主要癥狀之一就是反復(fù)潮熱，因此，使用生地可清熱涼血，去除陰虛骨蒸之熱。

通過(guò)對(duì)治療肺結(jié)核藥對(duì)使用情況的分析發(fā)現(xiàn)，甘草-當(dāng)歸是最高頻次的使用藥對(duì)，二藥同屬補(bǔ)虛藥，說(shuō)明補(bǔ)虛培元，增強(qiáng)正氣是治療肺結(jié)核中最重要的治法。當(dāng)歸屬補(bǔ)虛藥中的補(bǔ)血藥同時(shí)有活血的功效，肺結(jié)核的基本病機(jī)是元?dú)馓澨?、肝腎不足、精血虧耗，使用補(bǔ)虛藥可益氣生津、化陰生血，行氣逐瘀、行津祛痰[19]。甘草-當(dāng)歸-生地3味藥的高頻次配伍模式及甘草-當(dāng)歸-生地-白芍4味藥高頻次配伍模式，體現(xiàn)了補(bǔ)虛藥與清熱藥配伍治療肺結(jié)核的配伍思路，可益氣養(yǎng)陰、清熱除蒸。分析治療肺結(jié)核的用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)若使用生地和白芍時(shí)，配伍當(dāng)歸的概率為95%，基本可認(rèn)為甘草-當(dāng)歸-生地-白芍為治療肺結(jié)核的核心中藥，同時(shí)也可根據(jù)病情適當(dāng)配伍其他種類(lèi)中藥，如配伍清熱涼血、止咳平喘、收斂止血及健脾利濕之品可肅清肺中痰瘀，防止肺氣損耗；輔以解表藥如柴胡、桂枝可加強(qiáng)宣肺止咳之效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門(mén)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物與疾病和靶點(diǎn)之間“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系的藥理學(xué)分支學(xué)科。中藥復(fù)方制劑成分比較復(fù)雜，作用機(jī)制尚不明確，影響了中藥復(fù)方制劑的臨床推廣和研發(fā)。凌彥博等[20]運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究中藥復(fù)方牛貝消核提取物可通過(guò)下調(diào)c-JUN末端激酶(JNK)信號(hào)通路發(fā)揮抗結(jié)核作用。筆者利用在線分析工具BATMAN-TCM獲取了治療肺結(jié)核的4味核心中藥組合(甘草-當(dāng)歸-生地-白芍)的277種結(jié)構(gòu)明確化合物的430個(gè)作用靶點(diǎn)，同時(shí)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)收集到2482個(gè)結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)，然后將整理的結(jié)核疾病靶標(biāo)與核心中藥有效成分靶點(diǎn)映射篩選出共同靶點(diǎn)92個(gè)，該92個(gè)共同靶點(diǎn)認(rèn)為是治療結(jié)核病的4味核心中藥抗結(jié)核的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)這92個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，核心中藥治療結(jié)核病的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集的生物學(xué)過(guò)程為：氧化還原、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、細(xì)胞程序性死亡和凋亡，這些生物學(xué)過(guò)程在核心中藥活性成分抗結(jié)核機(jī)制及靶點(diǎn)所涉及的通路都有所體現(xiàn)。KEGG通路富集表明，4味核心中藥抗結(jié)核所涉及的通路主要包括癌癥通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、ErbB信號(hào)通路等，其中已有自然殺傷細(xì)胞抵抗結(jié)核分枝桿菌的報(bào)道，自然殺傷細(xì)胞具有殺滅感染細(xì)胞和清除細(xì)胞內(nèi)病原體宿主的能力，在病毒和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的免疫應(yīng)答中起著重要的作用[21]。γ干擾素(IFN-γ)能夠通過(guò)激活巨噬細(xì)胞及增強(qiáng)殺菌活性從而抵抗結(jié)核分枝桿菌，而自然殺傷細(xì)胞是IFN-γ的重要來(lái)源[22]。Feng等[23]發(fā)現(xiàn)，在感染結(jié)核分枝桿菌的Rag敲除小鼠的自然殺傷細(xì)胞可通過(guò)分泌IFN-γ抵抗肺結(jié)核。對(duì)于ErbB信號(hào)通路與結(jié)核病的關(guān)系也有研究，ErbB屬于EGFR家族成員，Sogi等[24]研究發(fā)現(xiàn)EGFR和ErbB2的小分子抑制劑吉非替尼可抑制巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究中筆者使用Rapidminer技術(shù)分析得出中藥治療肺結(jié)核多以補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥、清熱藥為主，且甘草、當(dāng)歸、生地、白芍這4味藥最常配伍使用；同時(shí)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)高頻次藥物甘草、當(dāng)歸、生地、白芍治療肺結(jié)核的作用機(jī)制可能是通過(guò)癌癥通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、ErbB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢?jiàn)，基于文本挖掘技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選統(tǒng)計(jì)及預(yù)測(cè)的結(jié)果與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究相符。因此，我們可以嘗試從此兩種角度研究中藥治療疾病的用藥規(guī)律和預(yù)測(cè)作用機(jī)制，為更深層次探索中藥研究提供參考。