李亞烜，劉俊榮，劉洋，閆麗新，王選飛，徐曇燁，田元勇

(大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023)

貝類是海洋生物中重要的經(jīng)濟資源類群，是中國海水養(yǎng)殖的第一大產(chǎn)業(yè)。根據(jù)2018年《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計,在國內(nèi)漁業(yè)生產(chǎn)中，貝類產(chǎn)量達1528萬t[1]。市售扇貝產(chǎn)品形式豐富多樣，其中以活品價值最高，活品品質控制是產(chǎn)業(yè)升值的核心問題。而蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis作為中國主要的經(jīng)濟貝類之一，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)主要分布在黃海海域，近年來，國內(nèi)外有關活品蝦夷扇貝研究主要圍繞流通過程中扇貝生化代謝展開[2-4]。

目前，對于扇貝從采捕至碼頭各個環(huán)節(jié)中，在生命科學和食品科學領域存在一個研究盲區(qū)，該盲區(qū)是活品供應鏈的品質易逝期，易逝期處置對于后期活力恢復及貯藏穩(wěn)定性有不可忽視的延遲效應。楊婷婷等[5]研究表明，活品蝦夷扇貝在捕后24 h呈現(xiàn)非愉悅的風味特征，經(jīng)海水暫養(yǎng)1～2 d后，活品風味及品質恢復明顯，以鮮、甜的愉悅風味特征為主。同樣，劉慧慧等[6]對活品菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum的研究發(fā)現(xiàn)，離水初期的急驟脅迫會導致蛤仔風味快速下降，而經(jīng)短時間的缺氧靜置(3 d內(nèi))其生化指標及風味品質均呈現(xiàn)恢復。本研究團隊通過實地調(diào)研[7]，了解到目前國內(nèi)蝦夷扇貝采捕方式主要分為人工潛水采捕和拖網(wǎng)采捕，其中，人工潛水采捕有利于保護海底生態(tài)環(huán)境，但這種采捕方式成本高，潛水員危險大；拖網(wǎng)采捕工作效率高，也是主要的采捕方式。歷經(jīng)網(wǎng)具、起網(wǎng)、甲板卸載、分選裝箱及海上轉運，采捕及捕后活體頻繁遭受擊打及露空等脅迫，捕后早期經(jīng)受的急驟脅迫所導致的應激脅迫壓力，對后續(xù)暫養(yǎng)凈化期間的恢復，以及后續(xù)流通環(huán)節(jié)的活品穩(wěn)定性具有重要影響。

本研究中，針對蝦夷扇貝離水早期面臨的最重要的脅迫因素，即缺氧和撞擊，對易逝期間扇貝活力的變化及后易逝期復水效果展開研究，并結合感官分析與生化指標分析，對扇貝活體的活力變化進行了跟蹤分析，旨在探討易逝期的脅迫處置對后易逝期扇貝活力恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用蝦夷扇貝為2018年12月份大連本地產(chǎn)商品規(guī)格蝦夷扇貝。殼長平均為110 mm，平均體質量為137 g，共購買200只活品底播蝦夷扇貝，均為大連長興水產(chǎn)品市場當日到貨，采用泡沫箱密封(碎冰降溫)，于1 h內(nèi)運至大連海洋大學水產(chǎn)品加工與貯藏實驗室，然后立即進行分選和貯藏處理，剔除活力弱或死亡的蝦夷扇貝。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處置及復水方案設計

(1)易逝期模擬。易逝期初始點設計：運抵實驗室的蝦夷扇貝活體原料處于應激狀態(tài)，將其立刻置于遼寧省水產(chǎn)設施養(yǎng)殖與裝備技術工程研究中心循環(huán)海水系統(tǒng)中進行24 h緩沖(圖1)。循環(huán)海水為經(jīng)3次沉淀的自然海水，溶解氧濃度為6.3 mg/L，溫度為6.9 ℃。將緩沖24 h后的扇貝記為初始狀態(tài)I組(initial)，待進入易逝期脅迫處理。

易逝期脅迫處置：易逝期處置為冷卻缺氧36 h，試驗設缺氧組E(emersed)和碰擊缺氧組E-S(emersed with mechanical shocking)兩個處理組。冷卻缺氧的方式為，取緩沖扇貝(I組)放置在泡沫箱內(nèi)(每箱10只，共6箱)，覆蓋浸濕的海綿及冰袋貯藏36 h，記為E組，冷卻缺氧環(huán)境參數(shù)的變化如圖2所示，平均溫度為2.8 ℃，濕度維持在83.9%左右。為模擬扇貝在捕撈操作中反復碰撞的實際情況，并參考Woll等[8]的試驗研究，將摔打處理方式設定為，先將扇貝(I組)于1 m高處自由跌落至水泥地，連續(xù)15次摔打后用同樣方式冷卻缺氧貯藏(每箱10只，共6箱)，記為E-S組。同時設濕藏對照組，將緩沖扇貝(I組)平鋪于網(wǎng)筐中全程置于循環(huán)海水中濕藏，記為C組。

(2)后易逝期復水處置。將上述易逝期脅迫36 h的處理組E和E-S扇貝放入循環(huán)海水系統(tǒng)中復水3 d記為復水組E′和E-S′，期間每日觀察死亡情況，至死亡率為50%時終止貯藏。試驗全程設暫養(yǎng)對照組C(control)。

試驗共設原料組R、緩沖組I、對照組C(濕藏組)，易逝期脅迫組E和E-S，以及后易逝期復水組E′和E-S′等，各組處置細則詳見表1。

表1 活體蝦夷扇貝各處理組設置與取樣細則Tab.1 Information on treatments and sampling specification of live yesso scallop Patinopecten yessoensis

1.2.2 分析測試

(1)各部位占比及肥滿度。感官分析后，將活貝樣品經(jīng)手工開殼，再依次分離閉殼肌、外套膜、性腺和鰓等軟體組織后稱重，隨即用液氮處理后于-80 ℃下保存待測。閉殼肌、性腺及外套膜為蝦夷扇貝的可食部位，可食部位組織質量占總質量的百分比即為肥滿度[9],并計算各部位的占比。

(2)感官分析?？s邊程度：蝦夷扇貝中心軸處外套膜與貝殼邊緣的距離，用直尺測量。

活力強度：空氣中處于開殼狀態(tài)活貝受外界刺激后主動閉合的時間。刺激方式采用針灸針輕微刺入閉殼肌，根據(jù)扇貝活力狀態(tài)，發(fā)生閉合的響應時間不同。受刺激后10 s內(nèi)發(fā)生自主閉合判定為強活力，10 s內(nèi)無自主閉合判定為弱活力。

圖像記錄：將活貝左殼剖離，平置余下的半殼扇貝進行拍照記錄，采用樣品攝影裝置。

(3)生化分析。pH值:取2.0 g扇貝橫紋肌，加入20 mmol/L的碘乙酸鈉10 mL，冰浴下用玻璃棒搗碎，靜置后用精密pH計測定閉殼肌pH值。

腺苷三磷酸(ATP)及其關聯(lián)化合物:取1.0 g扇貝橫紋肌，加入10 mL 5% PCA溶液，冰浴條件下?lián)v碎10 min，用2 mol/L KOH調(diào)pH后定容至20 mL，離心并取上清液，過濾后加入1 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液，用高效液相色譜法進行分析。

磷酸精氨酸(ArP):提取方法同ATP關聯(lián)物，采用高效液相色譜法進行分析。

腺苷酸能荷(adenylate energy charge，AEC)：計算公式為

AEC=(2ATP+ADP)/[2(ATP+ADP+AMP)]。

糖原含量：用蒽酮比色法于620 nm下測定吸光度后計算葡萄糖含量。糖原含量為葡萄糖含量的1.11倍。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結果均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 易逝期的初始點

為模擬易逝期，采捕離水前活體的狀態(tài)即易逝期起始點是關鍵?？紤]到抵達實驗室的原料處于急驟應激狀態(tài)，故先將扇貝置于循環(huán)海水系統(tǒng)中暫養(yǎng)緩沖，目的是消除活體高強脅迫壓力，最大程度地模擬離水點狀態(tài)即易逝期初始點。本試驗中，活體扇貝原料(10只)的殼長、殼高、殼厚分別為(110.1±4.0)、(113.7±3.0)、(22.7±2.0)mm，體質量為(137±22)g。經(jīng)計算得出：扇貝各部位質量占全貝質量的百分比依次為貝殼57.5%、軟體組織40.1%、閉殼肌10.3%；總可食部位占扇貝總質量的比例即肥滿度為28.4%；總軟體組織中閉殼肌占25.7%，生殖腺和外套膜分別占15.6%和29.5%。

表2為活體蝦夷扇貝原料暫養(yǎng)緩沖24 h的效果。原料(R組)采捕經(jīng)運輸?shù)竭_水產(chǎn)市場，因頻繁暴露在空氣中，體腔液流失致使體質量下降，經(jīng)緩沖后扇貝體質量明顯增加，扇貝縮邊程度減??；生化指標經(jīng)緩沖后均有所恢復，其中，糖原、ATP含量和ACE值明顯上升，扇貝活力增加。由此可見，24 h循環(huán)海水緩沖有明顯恢復效果。

2.2 易逝期脅迫對活品能量指標的影響

2.2.1 ATP及其關聯(lián)化合物含量及AEC值 從圖3可見：0～36 h缺氧貯藏過程中，缺氧E組的ATP含量前12 h基本保持不變，隨后由5.52 μmol/g緩慢下降到36 h的4.84 μmol/g，而缺氧碰撞E-S組在12 h后下降幅度較對照組明顯，36 h達到最小值3.89 μmol/g；E組與E-S組ADP含量在24 h內(nèi)變化趨勢相似，36 h兩組ADP含量均略有增加；與對照組相比，易逝期內(nèi)兩個處理組蝦夷扇貝的AEC值均呈下降趨勢。

2.2.2 ArP含量 從圖4可見：與對照組相比，缺氧E組和缺氧碰撞E-S組在短期內(nèi)(12 h)，ArP變化趨勢無明顯差異，均呈下降趨勢；隨著缺氧時間延長，二者的變化呈現(xiàn)明顯差異。

2.2.3 pH值及糖原含量 從圖5可見：與對照組相比，缺氧E組貯藏36 h的過程中，肌肉pH值呈緩慢下降趨勢，E、E-S處理組在易逝期前12 h下降趨勢相似，缺氧碰撞E-S組在12 h后下降趨勢比E組更加明顯，在36 h達到最小值7.17；E組和E-S組在易逝期內(nèi)糖原含量均呈下降趨勢，隨著缺氧時間延長，E-S組的糖原含量在12 h后快速下降，36 h時糖原含量僅為初始值的65%。

2.3 后易逝期扇貝活力恢復效果

2.3.1 ATP及其關聯(lián)化合物含量及AEC值 從圖6可見：初始點I組扇貝ATP、ADP含量及AEC值分別為5.65 μmol/g、0.49 μmol/g及0.95；復水后E、E-S兩個處理組的ATP含量及AEC值的恢復性與初始點相比均有顯著性差異(P<0.05)，E組ATP含量及AEC值分別由易逝期的4.84 μmol/g及0.91恢復至5.21 μmol/g及0.96(E′組)，接近初始點I組；E-S組ATP及AEC則未恢復且持續(xù)下降，由易逝期的3.90 μmol/g及0.94下降到3.52 μmol/g及0.79(E-S′組)。

2.3.2 ArP含量 從圖7可見：初始點I組扇貝ArP含量為9.59 μmol/g，缺氧E組復水3 d后含量恢復至9.16 μmol/g(E′組)，與對照組接近；缺氧碰撞E-S組雖然在冷卻缺氧結束時ArP含量與初始點I組扇貝ArP含量無顯著性差異(P>0.05)，但復水3 d后ArP含量持續(xù)下降至4.38 μmol/g(E-S′組)(P<0.05)。

2.3.3 pH值及糖原含量 從圖8可見：復水3 d后，缺氧E組蝦夷扇貝肌肉pH值恢復到7.29(E′組)，與初始點I組肌肉pH 7.32接近(P>0.05)，而缺氧碰撞E-S組在冷卻缺氧結束后pH值繼續(xù)下降至6.90(E-S′組)，與初始點I組有顯著性差異(P<0.05)；復水3 d后，E組扇貝糖原含量恢復至27.84 mg/g(E′組)，E-S組在冷卻缺氧期間糖原與初始點I組相比顯著下降(P<0.05)，其與復水后(E-S′組)無明顯變化(P>0.05)。

2.4 扇貝活力的感官特性變化

從表3可見：初始點I組扇貝均處于強活力狀態(tài)，外部刺激后迅速發(fā)生強有力的自主閉合，10 s內(nèi)閉合次數(shù)不等，為3～5次；缺氧組在初期活力表現(xiàn)良好，刺激外套膜和閉殼肌后10 s內(nèi)自主閉合且有力，缺氧貯藏12 h之后活力弱的扇貝開始出現(xiàn)，經(jīng)3 d復水后，樣品扇貝均恢復至強活力狀態(tài)；缺氧碰撞組扇貝在缺氧貯藏3 h就開始出現(xiàn)活力下降，弱活力扇貝達10%，且隨著缺氧時間延長，活力弱的扇貝數(shù)量越來越多，在復水3 d后，活力極差，多數(shù)扇貝閉殼肌無自主收縮能力，弱活力扇貝數(shù)量達90%，且內(nèi)部組織表面附著黏液。

表3 脅迫強度對蝦夷扇貝感官活力(弱活力狀態(tài)扇貝占比)的影響Tab.3 Effects of stress intensity on sensory vitality of yesso scallop Patinopecten yessoensis (percent of weak scallop in total scallop) %

軟體組織縮邊程度及外觀變化分析結果如圖9、圖10所示，初始點I組扇貝外套膜飽滿，幾乎無縮邊；隨著干露時間延長，缺氧組E和缺氧碰撞E-S組逐漸出現(xiàn)縮邊現(xiàn)象，脅迫強度與縮邊程度呈現(xiàn)正相關；至貯藏36 h時，E組扇貝的外套膜縮邊程度平均從0.0 mm增加到6.8 mm左右，E-S組則從0.0 mm增加到9.0 mm左右，縮邊的同時伴隨著體腔液流失。復水3 d后，E組扇貝縮邊現(xiàn)象有所恢復，外套膜恢復飽滿各部位清楚可見；同樣，E-S組縮邊程度顯著增加，由9.0 mm增加到23.1 mm，外套膜縮邊則未恢復且失去與貝殼粘連性，各軟體組織邊緣模糊，整體品質下降明顯。

3 討論

3.1 易逝期脅迫對活體扇貝生理狀態(tài)的影響

本研究表明，在相同冷卻缺氧貯藏條件下，離水初期遭受高強度物理脅迫的扇貝與無摔打扇貝相比，易逝期內(nèi)具有更強烈的應激反應，同時，摔打對扇貝活力影響滯后，在易逝期內(nèi)就出現(xiàn)了明顯的延遲效應，兩個處理組在12 h之后生理代謝差異越來越明顯，品質有所區(qū)別。

ATP在提供能量時轉化成ADP和AMP[6]， ATP主要通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生，這一過程需要氧氣參與。本研究中，在冷卻缺氧中蝦夷扇貝無充足氧氣，無法維持ATP含量穩(wěn)定，所以兩個處理組的ATP均有下降趨勢；與缺氧E組相比，離水后遭受高強度碰擊的E-S組，在12 h后ATP呈現(xiàn)陡然下降的趨勢。

AEC值廣泛應用于評價貝類的生理狀態(tài)，能夠靈敏地反映貝類所受到的脅迫，AEC值為0.8～0.9時貝類狀態(tài)良好可繁殖，為0.5～0.7時貝類處于緩慢生長但可恢復繁殖狀態(tài)，為0.5以下時貝類無法繁殖且為不可逆狀態(tài)[10]。Maguire等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，扇貝缺氧6 h后AEC值變化呈類似的趨勢。磷酸精氨酸(ArP)是無脊椎動物體內(nèi)重要的磷酸原，其作用類似于脊椎動物體內(nèi)的磷酸肌酸[12]。當ATP大量消耗時，ArP在精氨酸激酶的作用下，可將高能磷酸鹽轉移給ADP從而合成ATP，此時ArP起到了ATP“緩沖池”作用[13]。本研究中在易逝期內(nèi)，在磷酸精氨酸激酶作用下ArP合成ATP，為缺氧貯藏提供了能量，所以缺氧E組和缺氧碰撞E-S組蝦夷扇貝的ArP整體上均呈下降趨勢。鄭堯[13]在缺氧條件下閉殼肌中能量物質的變化研究中發(fā)現(xiàn)，ArP含量在缺氧3 d后幾乎完全耗盡，與本研究結果一致。

pH值是反映貝類生化狀態(tài)的指標，本研究中由于供氧量低，缺氧組扇貝主要進行無氧呼吸產(chǎn)生章魚堿等酸性物質，隨貯藏時間延長pH值下降，也有可能是由OpDHs生成opins引起的[14]。將獅爪扇貝Nodipectensubnodosus活體解剖后閉殼肌冰藏，其肌肉pH在15 d內(nèi)無明顯變化[15]，可能是由于冰藏鮮品與凍品代謝通路不一樣。Fatima等[16]研究表明，若pH顯著增加，則表明隨著時間的推移細菌的堿性代謝物積累，龍蝦肌肉在冰中儲存15 d后，細菌數(shù)量較少且肌肉無腐敗。

糖原又稱肝糖或糖元，是一種動物淀粉，由葡萄糖結合而成的支鏈多糖；盡管磷酸鹽和L-天冬氨酸是厭氧能量提供的主要基質，但糖原是厭氧能量過程中的主要能量來源[17]。在冷卻缺氧貯藏過程中，糖原是扇貝饑餓狀態(tài)下的主要供能物質[18]，本研究中，與對照組相比，兩個處理組糖原含量持續(xù)下降，扇貝閉殼肌中的生理性糖原分解似乎受磷酸化酶活性的變化調(diào)節(jié)，這取決于葡萄糖、AMP和ATP的濃度[19]。

3.2 不同脅迫強度對后易逝期活體扇貝活力恢復效果的影響

本研究表明，易逝期內(nèi)缺氧脅迫對扇貝生理影響較強烈，但扇貝返回“舒適”環(huán)境后狀態(tài)可恢復，缺氧并不會對活體造成負面的延遲效應，物理撞擊雖然在易逝期內(nèi)對生化指標影響表現(xiàn)不明顯，但復水后扇貝活力明顯下降，表明易逝期撞擊形成的物理脅迫對活體活力造成了不可逆性損傷，對后易逝期活品呈現(xiàn)明顯的負面延遲效應。

本研究中，缺氧組E復水后ATP關聯(lián)物含量逐漸接近初始值，生化代謝趨于穩(wěn)定；而缺氧碰撞E-S組扇貝ATP關聯(lián)物含量與初始值具有顯著性差異。劉金洋等[10]在蝦夷扇貝缺氧復水研究中也發(fā)現(xiàn)同樣現(xiàn)象，扇貝在低溫下干藏0、12、24 h后復水，ATP含量呈恢復趨勢。AEC值更直觀顯示了蝦夷扇貝復水3 d后的生理狀態(tài)，缺氧組E狀態(tài)良好，缺氧碰撞E-S組不僅未恢復且活力更差。值得關注的是，易逝期結束時，E組與E-S組的AEC值并無顯著性差異，易逝期的滯后表現(xiàn)在復水后二者的差異。捕后早期物理撞擊脅迫對扇貝活體的延遲效應不可忽視，對后續(xù)的活品扇貝流通品質極為不利。ArP變化相對于ATP能從更早的階段靈敏準確地反映活品品質，復水后E-S組ArP含量持續(xù)下降，與缺氧組E組扇貝品質出現(xiàn)明顯區(qū)別。糖酵解生成的丙酮酸被氧化成乙酸，可導致pH不斷下降[20]，故扇貝摔打后可能由于代謝模式改變，即使回到循環(huán)海水環(huán)境中，酸性物質也持續(xù)積累導致pH值持續(xù)下降。Hummel等[21]發(fā)現(xiàn)，在糖原含量較高的動物中，開始3～7 d內(nèi)分別在高溫和低溫下糖原不被使用，在這一潛伏期后，糖原濃度往往下降，同時伴隨著高死亡率和乙酸濃度的增加。本研究中復水后，扇貝的呼吸方式恢復至有氧方式，生理代謝恢復正常，糖原含量有所積累，但缺氧碰撞組由于扇貝活力較弱，故糖原含量低且無恢復。劉金洋等[10]的試驗也證明，與缺氧、溫度脅迫相比，摔打后扇貝復水期間糖原含量低且無恢復，再次證明了早期物理撞擊對蝦夷扇貝的復水后生理影響強烈且不可逆。

3.3 不同脅迫強度對扇貝活力及感官的影響

感官評價方法對于水產(chǎn)品品質評價非常重要，廣泛用于水產(chǎn)原料的鮮度判別及水產(chǎn)品風味品質特性分析。針對水產(chǎn)品鮮度，Bernardi等[22]開發(fā)了一種感官方法即質量指數(shù)方法(QIM)，是基于質量測量的結構化縮放，并提供關于新鮮度的準確信息，以及對特定魚類剩余保質期的預測；隨后，Lanzarin等[23]運用Bernardi等[22]創(chuàng)立的QIM法對冰藏亞馬遜大西洋馬鮫進行貨架期預測。

有關貝類的感官分析，目前主要圍繞活品風味品質進行評價，楊婷婷等[5]通過建立感官分析描述詞以便能夠客觀評價活品底播蝦夷扇貝的風味品質，劉慧慧[24]建立了活品菲律賓蛤仔感官評價小組，通過征集、篩選感官描述詞，最終確立了30個菲律賓蛤仔的感官描述詞。對于貝類活力狀態(tài)的感官評價尚缺乏深入科學的研究報道。感官法是貝類活力評價最直接有效的方法，本研究團隊基于研究實踐操作經(jīng)驗積累及相關科學理論，嘗試建立標準化刺激響應方案，籍此規(guī)范活品蝦夷扇貝感官活力評價方法。本研究中，結合對“縮邊”和軟體組織等變化的觀測，經(jīng)多種嘗試，發(fā)現(xiàn)針灸針刺激扇貝外套膜和閉殼肌，可模仿海星觸角的方法，從而判斷扇貝活力及對外界刺激反應是否靈敏，其優(yōu)點是簡單便捷、樣品保存完好且對活力無影響，測試人員幾乎不需要專業(yè)培訓。

結合感官分析與生化指標分析結果，可知捕后早期脅迫強度越大，扇貝越易逝；適度脅迫復水后扇貝活力可恢復，過度脅迫扇貝活力可恢復性極差甚至不可恢復，具有明顯的延遲效應。然而，活品活力變化過程復雜，需將此方法進一步細化，以便更真實準確地反映蝦夷貝類捕后活力變化情況。

4 結論

(1)活體原料經(jīng)緩沖后對消除外界脅迫應激有積極影響，緩沖后各項活力指標均得以有效恢復，其中ATP含量、糖原含量及AEC值均上升。

(2)易逝期缺氧和碰擊脅迫對活體蝦夷扇貝均造成活力損傷，各項生化指標均呈下降趨勢，感官活力缺氧E組和缺氧碰撞E-S組兩個處理組出現(xiàn)不同程度的縮邊，與E組相比，E-S組對外界刺激響應更加遲鈍。

(3)后易逝期結束時，E組和E-S組活品可恢復性呈現(xiàn)顯著差異，E組各項生命指標有所恢復并對外部刺激的反應靈敏，而E-S組生命指標不可恢復且對外部刺激的反應非常遲緩。

可見，品質易逝期QDP內(nèi)脅迫強度的調(diào)控對后易逝期P-QDP環(huán)節(jié)活品活力狀態(tài)有延遲效應；早期脅迫強度越高，復水后的活力可恢復性越低，勢必會影響活品的貨架壽命。