馬紅麗，孫娜，陸曉岑，劉建男，郭思聰，趙小然，葉仕根*

(1.大連海洋大學(xué) 大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023； 2.盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司 遼寧省中華絨螯蟹育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 盤(pán)錦 124200)

中華絨螯蟹Eriocheirsinensis又稱(chēng)河蟹，是中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一[1]。2016年中國(guó)中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)81.21萬(wàn)t，產(chǎn)值1031.53萬(wàn)美元。隨著中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，其病害日趨增多。目前，報(bào)道的蟹類(lèi)病害主要有螺原體Spiroplasma感染引起的中華絨螯蟹抖抖病[2]，鰻弧菌Vibrioanguillarum[3]、副溶血弧菌Vibrioparahemolyticus[4]等感染引起的弧菌病，以及固著類(lèi)纖毛蟲(chóng)寄生引起的寄生蟲(chóng)病[5]。2005年，許文軍等[6]報(bào)道了一例三疣梭子蟹Portunustrituberculatus“牛奶病”，認(rèn)為該病是由假絲酵母菌Candidaoleophila感染引起的。也有人認(rèn)為三疣梭子蟹 “牛奶病”是由溶藻弧菌Vibrioalginolyticus和葡萄牙假絲酵母Candidalusitaniae混合感染引起的[7]。目前，有關(guān)蟹類(lèi)“牛奶病”的病因尚有爭(zhēng)議。

2018年10月，遼寧省盤(pán)錦地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)現(xiàn)部分頭胸甲蓄積大量牛奶狀液體的病蟹，養(yǎng)殖戶稱(chēng)其為“牛奶病”。病蟹活力減弱、步足易脫落、易死亡。2019年4月，遼寧省多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)再次發(fā)現(xiàn)類(lèi)似病癥，且發(fā)病率和死亡率較2018年更高，其中，10%的中華絨螯蟹具有明顯癥狀，估計(jì)總體發(fā)病率(感染率)達(dá)30%。為此，本研究中對(duì)病蟹進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查、病原分離、鑒定，以及人工回感試驗(yàn)，證實(shí)遼寧地區(qū)中華絨螯蟹的“牛奶病”是由二尖梅奇酵母Metschnikowiabicuspidata感染所致，這也是首次發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)酵母類(lèi)真菌是中華絨螯蟹“牛奶病”的病原。研究結(jié)果可為中華絨螯蟹“牛奶病”的診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

患病中華絨螯蟹取自遼寧省盤(pán)錦市某養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為25～35 g。健康中華絨螯蟹由遼寧省盤(pán)錦市光合蟹業(yè)有限公司提供，體質(zhì)量為5～15 g。

Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。酮康唑、氟康唑、益康唑、克霉唑、兩性霉素B、伊曲康唑、制霉菌素購(gòu)自海邁科技(大連)有限公司；多西環(huán)素、頭孢曲松購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病蟹臨床檢查 無(wú)菌條件下解剖病蟹，觀察各器官的變化。取病蟹頭胸甲腔蓄積的牛奶狀液體經(jīng)迪夫快速染色后鏡檢觀察。試驗(yàn)中取病蟹的肝胰腺、鰓、肌肉等組織塊，用10%福爾馬林固定。常規(guī)石蠟切片、H.E染色后，檢查其組織病理變化及病原菌分布情況。

1.2.2 人工感染試驗(yàn) 人工感染試驗(yàn)采用浸泡法,選取60只健康中華絨螯蟹隨機(jī)分為4組，每組15只，其中對(duì)照組浸泡于生理鹽水，3個(gè)試驗(yàn)組分別浸泡于濃度為1×107、1×108、1×109CFU/mL的菌液中，各試驗(yàn)組浸泡時(shí)間均為3 h[7]。試驗(yàn)期間水溫為(18±1) ℃，隔天投喂飼料，觀察并記錄其活動(dòng)及發(fā)病情況，連續(xù)觀察兩個(gè)月。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將菌液均勻涂布于NA培養(yǎng)基，待表面晾干后貼上藥敏紙片，28 ℃下培養(yǎng)36 h后測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 病原分離與鑒定

(1)分離。取20只發(fā)病癥狀典型的中華絨螯蟹，用75%的酒精棉球擦拭病蟹體表和腹部，掀開(kāi)頭胸甲，無(wú)菌操作取病蟹牛奶狀液體，肌肉組織劃線接種于NA和YPD培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)36 h后，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

(2)生理生化指標(biāo)測(cè)定。將分離菌株進(jìn)行糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、明膠液化和淀粉水解試驗(yàn)[8]。

(3)18S rDNA擴(kuò)增與測(cè)序。將分離菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，用DNA抽提試劑盒提取分離菌的DNA，引物序列為正向引物 5′CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA 3′和反向引物 5′CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT 3′[9]。PCR反應(yīng)體系(共25 μL):10×buffer(含Mg2+)21.5 μL，dNTP 0.25 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶 0.25 μL，用雙蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃下預(yù)變性5 min； 94 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI網(wǎng)站申請(qǐng)GenBank登錄號(hào)，并進(jìn)行BLAST比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀、病原分離、組織病理變化

試驗(yàn)中病蟹活力較弱。攝食減少或不攝食、步足發(fā)白易脫落，除部分病蟹出現(xiàn)花蓋外，體表未見(jiàn)明顯異常。掀開(kāi)頭胸甲可見(jiàn)大量白色牛奶狀液體(圖1-A)，全身肌肉水腫且不飽滿。用迪夫快速染色后在顯微鏡鏡下觀察，結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了頭胸甲腔積液中的菌體形態(tài)(圖1-B、C)。從病蟹頭胸甲腔蓄積的牛奶狀液體及肌肉中分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌，記為2EJM001,該菌在28 ℃條件下可生長(zhǎng)在YPD和NA培養(yǎng)基上，形成1～3 mm 白色不透明隆起圓形菌落。取病蟹肌肉、鰓、肝胰腺等制作組織切片，H.E染色后觀察發(fā)現(xiàn)病變最嚴(yán)重的為肌肉組織，主要表現(xiàn)為肌纖維結(jié)構(gòu)松散、橫紋消失、部分區(qū)域溶解液化；菌體定殖的肌纖維萎縮，有的部位菌體聚集成團(tuán)，在鏡下呈串珠狀排列(圖1-D)。

2.2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

從表1可見(jiàn)：用分離純化后的菌株2EJM001感染健康中華絨螯蟹，各試驗(yàn)組半個(gè)月后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，到試驗(yàn)結(jié)束后，1×107、1×108、1×109CFU/mL菌液注射試驗(yàn)組累計(jì)死亡率分別為33%、40%和53%。病死蟹頭胸甲腔蓄積牛奶狀液體，癥狀與自然發(fā)病的病蟹相同，對(duì)照組和試驗(yàn)組均有蛻殼后被其他蟹殘食現(xiàn)象。從人工感染病蟹的肌肉和頭胸甲腔蓄積的牛奶狀液體中再分離菌株記為2EJM002，1×107、 1×108、1×109CFU/mL菌液注射試驗(yàn)組的2EJM002分離率分別為0%、9%和83%。

表1 人工感染試驗(yàn)(n=15)Tab.1 Artificial infection test of the isolate 2EJM001(n=15)

用人工感染病蟹的頭胸甲腔牛奶狀液體涂片，染色鏡檢同樣可見(jiàn)大量該種病原微生物，從人工感染病蟹肌肉和頭胸甲腔蓄積的牛奶狀液體中再分離的2EJM002菌株與自然感染病蟹分離菌株2EJM001菌落的形態(tài)及大小相同，培養(yǎng)特性完全一致。

2.3 藥敏試驗(yàn)與生理生化結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)酮康唑、氟康唑、益康唑、克霉唑、兩性霉素B、伊曲康唑、制霉菌素高度敏感；對(duì)多西環(huán)素、頭孢曲松不敏感(表2)。

表2 菌株2EJM001藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antibiotic susceptibility test results of strain 2EJM001

從表3可見(jiàn)：生理生化反應(yīng)結(jié)果顯示，2EJM001病原菌可以使明膠液化，可發(fā)酵葡萄糖，不可發(fā)酵乳糖、棉子糖、密二糖、半乳糖、麥芽糖和水解淀粉，除硝酸鹽還原為陰性與二尖梅奇酵母參考菌株WCY不同外，其他結(jié)果完全相同。

表3 病原菌生理生化結(jié)果Tab.3 Physicochemical results of pathogenic bacteria

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用特異性引物擴(kuò)增菌株2EJM001的18S rDNA，獲得大小為1900 bp左右的目的片段，將基因序列提交GeneBank并獲得登錄號(hào)為MN511840.1，其18S rDNA序列與二尖梅奇酵母一致性為99.53%且二者自然聚為一支,親緣關(guān)系較近(圖2)。最終，經(jīng)生理生化、18S rDNA分子鑒定，2EJM001為二尖梅奇酵母。

3 討論

3.1 酵母的致病性

酵母是一類(lèi)以芽殖、異養(yǎng)兼性厭氧、發(fā)酵糖類(lèi)[11]為特征的單細(xì)胞真核微生物，在農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)療領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用[12]。許多酵母具很強(qiáng)的生物拮抗作用，可抑制或殺滅植物、動(dòng)物和人類(lèi)的病原體，如釀酒酵母Saccharomycescerevisiae通過(guò)抑制鼠傷寒沙門(mén)菌Salmonellatyphimurium來(lái)保護(hù)小鼠消化道[13]，還可制備重組疫苗有效抵抗人類(lèi)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染[14]；梅奇酵母Metschnikowiazizyphicola可抑制冬棗采后青霉病、黑斑病[15]和芒果炭疽病[16]的發(fā)生。酵母也是人類(lèi)、動(dòng)植物常見(jiàn)病原類(lèi)型之一，如新型隱球酵母Cryptococcusneoformans可導(dǎo)致人類(lèi)腦膜炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[17]；點(diǎn)滴腹膜酵母Cyniclomycesguttulatus可引起犬出現(xiàn)腹瀉血便癥狀[18]；東方畢赤酵母Pichiaoccidentalis和東方伊薩酵母Issatchenkiaoccidentalis可引發(fā)葡萄酸腐病[19]。此外，酵母也可對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物致病，如Debaryomyceshansenii[20]和Torulopsismogii[21]酵母可導(dǎo)致養(yǎng)殖羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii暴發(fā)性死亡。目前，有關(guān)二尖梅奇酵母的水生動(dòng)物宿主有奇努克鮭魚(yú)Chinooksalmon[22]、羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii[23]和三疣梭子蟹Portunustrituberculatus等[24]。本研究中，通過(guò)病原分離、鑒定和人工感染試驗(yàn),首次證實(shí)了二尖梅奇酵母是遼寧地區(qū)中華絨螯蟹“牛奶病”的致病病原。

3.2 蟹類(lèi)“牛奶病”病原分析

“牛奶病”是近年來(lái)蟹類(lèi)養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)生的一種以頭胸甲腔蓄積牛奶狀液體為特征的蟹類(lèi)疾病癥狀。早在20世紀(jì)90年初便有此癥狀的病蟹發(fā)現(xiàn)，但由于當(dāng)時(shí)養(yǎng)殖規(guī)模小，放養(yǎng)密度稀，病情及死亡較輕而未引起重視。然而，近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的提高和養(yǎng)殖環(huán)境條件的日益變差，此癥狀日益多見(jiàn)，相關(guān)疾病已成為嚴(yán)重制約蟹類(lèi)養(yǎng)殖健康發(fā)展的重要因素。這類(lèi)癥狀曾在不同品種的蟹中出現(xiàn)，如惡臭假單胞菌Portunustritubercularu[25]、血卵渦鞭蟲(chóng)Hematodiniumsp.[26]可引起的三疣梭子蟹的“牛奶病”，肝孢子蟲(chóng)Hepatosporaeriocheir[27]寄生可引起中華絨螯蟹的“牛奶病”。這3種病原可通過(guò)鏡下觀察區(qū)分，惡臭假單胞菌為短桿狀細(xì)菌，血卵渦鞭蟲(chóng)多數(shù)呈卵圓形，單核或多核，有2根長(zhǎng)度不等的鞭毛。肝孢子蟲(chóng)感染時(shí)，病蟹肝胰腺濕涂片中可見(jiàn)大量成熟孢子。此外，溶藻弧菌和葡萄牙假絲酵母混合感染也可引起蟹類(lèi)“牛奶病”[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)，二尖梅奇酵母也可導(dǎo)致中華絨螯蟹出現(xiàn)與上述病例相似的臨床癥狀，但病原和病因不同，用“牛奶病”來(lái)命名和診斷是不科學(xué)的。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)相關(guān)病例的檢查及病原、病因分析。

3.3 酵母菌的感染與致病

動(dòng)物酵母性疾病的發(fā)生與病原數(shù)量、物種種類(lèi)及體質(zhì)狀況有較大關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)，不同濃度攻毒下的中華絨螯蟹死亡率和分離率差異顯著，故證實(shí)病原酵母的數(shù)量會(huì)直接影響疾病的發(fā)生與發(fā)展。施慧等發(fā)現(xiàn)[28]，不同品種蟹對(duì)酵母抵抗力有差異，在相同濃度酵母攻毒下三疣梭子蟹、紅星梭子蟹和日本鱘均發(fā)病，但是癥狀輕重不一。酵母感染通常與宿主健康狀況密切相關(guān)，一旦宿主健康狀況不良時(shí)，則此潛在病原將嚴(yán)重侵害宿主機(jī)體。在(18±1)℃溫度下，感染蟹一般需要15 d以上才出現(xiàn)死亡，說(shuō)明該病是一個(gè)慢性發(fā)展的過(guò)程。本研究中發(fā)現(xiàn)，頭胸甲腔內(nèi)蓄積牛奶狀液體的病蟹仍可存活較長(zhǎng)時(shí)間，與自然條件下發(fā)現(xiàn)的病蟹非常相似。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，常見(jiàn)抗真菌藥物對(duì)二尖梅奇酵母都有較好的體外抑制作用。但在臨床治療時(shí)還應(yīng)考慮藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝及藥物殘留等情況。上述藥物僅能用于應(yīng)急治療，不可用于常規(guī)防治。需要強(qiáng)調(diào)的是目前沒(méi)有水產(chǎn)專(zhuān)用的抗真菌藥物。因此，當(dāng)蟹類(lèi)出現(xiàn)“牛奶病”癥狀時(shí)，病情已進(jìn)入感染后期階段且難以治療，所以要做到早發(fā)現(xiàn)、早處置。有關(guān)該病的流行規(guī)律、致病機(jī)制等目前仍不明確，也沒(méi)有有效的防控措施。下一步應(yīng)加強(qiáng)中華絨螯蟹“牛奶病”的發(fā)病機(jī)制、早期檢測(cè)與快速診斷技術(shù)，以及疾病綜合防控措施的研究。