劉建男，郭羿，倪萍，郭思聰，馬紅麗,陸曉岑，葉仕根

(大連海洋大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連市海珍品疾病防控重點實驗室，遼寧 大連 116023)

殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida隸屬氣單胞菌科Aeromonadacea氣單胞菌屬Aeromonas，為已知最古老的魚類病原體之一[1-2]。殺鮭氣單胞菌是鮭科Salmonidae魚類重要的病原菌，可引發(fā)鮭科魚類“癤瘡病”[3]。最初學界認為，殺鮭氣單胞菌具有宿主專一性，但深入研究后發(fā)現(xiàn)其宿主并不僅限于此，還可感染鯉Cyprinuscarpio[4]、鱈Gadusmorhua[5]、許氏平鲉Sebastesschlegeli[6]、烏鱧Channaargus[7]、異育銀鯽Carassiusauratusgibelio[8]、大菱鲆Scophthatmusmaximus[9]等多種魚類。1992年Toranzo等[10]首次從西班牙某養(yǎng)殖場患病大菱鲆體內(nèi)分離到殺鮭氣單胞菌，隨后類似病例相繼在丹麥[11]、挪威[12]和中國[13]等地被報道。殺鮭氣單胞菌的感染給大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。

大菱鲆隸屬于鰈形目Pleuronectoidei菱鲆科Scophthalmidae瘤棘鲆屬Psetta，原產(chǎn)于大西洋東北沿岸，俗稱歐洲比目魚，在中國又稱“多寶魚”，是一種極具經(jīng)濟價值的冷水性魚類[14-16]。2017年，中國大菱鲆年產(chǎn)量高達45 500 t，年產(chǎn)值已達29 575萬美元(http://www.fao.org/fishery/statistics)，大菱鲆已成為中國鰈鲆類養(yǎng)殖第一大品種。然而，隨著大菱鲆養(yǎng)殖集約化程度不斷提高、養(yǎng)殖密度日益加大，大菱鲆病害頻發(fā)，各種病毒性疾病、細菌性疾病和寄生蟲病的報道日漸增多[17-19]。2018年4月，遼寧省大連市某養(yǎng)殖場大菱鲆暴發(fā)了流行性疾病，其皮膚呈串珠狀隆起、變白且隆起部分皮下肌肉出血、化膿、潰爛，兩天內(nèi)累計死亡率高達10%，作者從患病大菱鲆體內(nèi)分離得到一株病原菌DLPJC01(GenBank登錄號：MK881070)，通過分子生物學鑒定及人工感染試驗證實，該病原菌為殺鮭氣單胞菌無色亞種。呂俊超等[20]雖于2008年報道了殺鮭氣單胞菌感染大菱鲆的組織病理學變化，但病魚卻未出現(xiàn)典型癤瘡癥狀，組織內(nèi)也未發(fā)現(xiàn)細菌存在。而本研究中病魚體表癤瘡癥狀典型，且各器官組織內(nèi)有大量細菌定殖，與之前報道有明顯差異。因此，本研究中在分析該分離株致病性的同時研究了患典型“癤瘡病”大菱鲆的病理損傷特征，以期為進一步研究殺鮭氣單胞菌的致病機制及臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病大菱鲆共計10尾，體質量為(180±10)g，體長為(15±3)cm，取自遼寧省大連市某養(yǎng)殖場海上養(yǎng)殖網(wǎng)箱。

健康大菱鲆共計30尾，體質量為(15±3)g，體長為(6±1)cm，購自遼寧省大連市某養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)于大連市海珍品疾病防控重點實驗室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。

藥敏紙片、細菌生化微量鑒定管購于杭州微生物試劑有限公司；結晶紫、伊紅、革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，細菌DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢查與病原菌分離 首先用肉眼觀察患病大菱鲆外觀癥狀，取病魚鰓絲與體表黏液鏡檢。然后解剖病魚，觀察病魚內(nèi)臟器官異常病變。無菌條件下取病魚肝、脾、腎等組織，劃線接種于含2%NaCl的NA平板，28 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢菌株分離純化。觀察菌落形態(tài)，挑取單個菌落進行革蘭氏染色。

1.2.2 人工感染試驗 分離菌株在含2%NaCl的NA平板上28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水沖洗平板上菌落，采用麥氏比濁法[21]調節(jié)菌懸液濃度至1×108、1×109cfu/mL。健康大菱鲆于實驗室暫養(yǎng)一周后，按照注射細菌濃度分組，分為1×108、1×109cfu/mL和對照組3組，每組10 尾魚。試驗組每尾魚腹腔注射0.1 mL菌液，對照組注射0.1 mL生理鹽水。注射后觀察大菱鲆的發(fā)病癥狀及死亡情況，連續(xù)觀察15 d。

1.2.3 生理生化鑒定及藥敏試驗 參照細菌生化微量鑒定管說明書鑒定分離菌株。采用紙片擴散法，將濃度為1×107cfu/mL菌液均勻涂布于含2%NaCl的NA平板后貼上藥敏紙片，28 ℃下培養(yǎng)24 h并測量抑菌圈直徑。

1.2.4 16S rDNA測序分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構建 使用細菌DNA提取試劑盒提取分離菌株的DNA后進行16S rDNA基因的PCR擴增。16S rDNA基因擴增引物(27F： 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′；1492R：5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′)，預期擴增片段大小約為1500 bp。PCR反應體系為：ddH2O 18.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA酶 0.25 μL，dNTP 1 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR反應程序為：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，54 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸90 s，共進行30個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后并送至北京華大基因有限公司測序。測序結果在GenBank中用Blast軟件進行比對，選擇相似度較高的序列用MEGA5軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。系統(tǒng)進化樹分支置信度用1000次重復自舉檢驗，在計算過程中，系統(tǒng)自動省略不確定和缺失的位點。

1.2.5 病理切片制作與觀察 取自然發(fā)病大菱鲆的肝、脾、腎、腸道、腦、鰓等組織，用10%甲醛溶液固定48 h，以健康大菱鲆組織為對照。修塊后逐級脫水，透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋后切片，切片厚度為4 μm。經(jīng)H.E染色，中性樹膠封片后用Leica DM4000 LED拍照系統(tǒng)觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 患病魚的臨床癥狀與病原菌分離結果

病魚體色發(fā)黑，體表黏液增多，靠近背鰭部分的背部肌肉呈串珠狀隆起，甚至連成一片，且隆起部位發(fā)白，劃開隆起的肌肉組織發(fā)現(xiàn)大菱鲆皮下肌肉出血、化膿、潰爛(圖1)。取病魚鰓絲和體表黏液鏡檢未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。解剖發(fā)現(xiàn)，部分病魚腹腔內(nèi)出現(xiàn)帶血腹水，病魚肝、脾、腎等內(nèi)臟器官充血及出血，脾臟和腎臟腫大，腸道發(fā)炎。

從發(fā)病大菱鲆體內(nèi)分離得到一株優(yōu)勢菌，在28 ℃條件下，該菌株在含2%NaCl的NA培養(yǎng)基上形成白色、中央略隆起、邊緣光滑、直徑為(0.9±0.1)mm的圓形菌落，且革蘭氏染色結果為陰性。

2.2 人工感染試驗結果

從表1可見：1×108cfu/mL試驗組大菱鲆死亡率達30%，1×109cfu/mL試驗組大菱鲆全部死亡，死亡大菱鲆均與自然發(fā)病條件下病魚癥狀相同；對照組無任何異常。

表1 人工感染試驗結果Tab.1 Challenage experiments results of the isolated strains DLPJC01

2.3 生理生化鑒定與藥物敏感性結果

從表2可見，生理生化比對發(fā)現(xiàn)，該菌株與殺鮭氣單胞菌無色亞種最為接近。

表2 DLPJC01與殺鮭氣單胞菌無色亞種的理化特性比較Tab.2 Comparisons of physicochemical characteristics of strain DLPJC01 with Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes

從表3可見：該菌株對慶大霉素、頭孢曲松、鏈霉素、頭孢噻肟、新霉素5種抗生素高度敏感；對紅霉素中度敏感；對復方新諾明、環(huán)丙沙星、卡那霉素等13種抗生素完全耐藥。

表3 菌株DLPJC01抗生素藥敏試驗結果 Tab.3 Antibiotic susceptibility of strain DLPJC01

2.4 16S rDNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

以分離菌株DLPJC01的DNA為模板，擴增的16S rDNA基因條帶均與預期相符，測序結果在GenBank中進行Blast比對，結果顯示，與登錄號為KX238884.1的殺鮭氣單胞菌無色亞種Aeromonassalmonicidasubsp.achromogenes相似度最高，可達99.9%以上。系統(tǒng)發(fā)育樹構建結果也顯示，DLPJC01菌株與殺鮭氣單胞菌聚為一支(圖2)。

2.5 組織病理變化

顯微鏡下觀察健康和自然發(fā)病大菱鲆各器官的組織切片,可見患病大菱鲆的鰓、肝臟、脾臟、腎臟、腸道和肌肉等處的組織均有極為明顯的病理變化(圖3)。鰓組織以鰓小片明顯水腫、增寬、間隔縮小為主要特征；鰓小片上皮細胞與毛細血管成片剝離(→)，大部分上皮細胞腫脹、變圓、相互離散，嚴重時完全脫落僅殘留光滑的血管內(nèi)皮細胞；毛細血管擴張淤血，內(nèi)有大量藍紫色細菌團塊形成栓子(★)，阻塞了毛細血管使其擴張，呈氣球狀甚至破裂出血(圖3-B)。肝組織的病變相對較輕，主要表現(xiàn)為小靜脈、中央靜脈和肝血竇擴張、淤血，部分區(qū)域紅細胞溶血；部分小靜脈血漿淤積，可見殘留的紅細胞碎片和細胞核，且組織中可見藍紫色的細菌團塊(圖3-D)。脾實質組織呈多發(fā)性灶性壞死，壞死組織紅染，細胞精細結構消失，僅殘留基本的細胞輪廓(→)，為典型的凝固性壞死，有的區(qū)域甚至溶解液化；組織中有大量藍紫色的細菌團塊(★)，細菌團塊交錯分布于著色深淺不一的壞死組織中，使整個脾臟在鏡下呈花斑狀(圖3-F)。腎間質呈多發(fā)性灶性壞死，部分壞死組織溶解、消失導致腎間質疏松，腎間質中還可見大量的藍紫色細菌團塊(★)；多數(shù)腎小管壞死，呈紅染狀，腎小管上皮細胞腫脹、變圓，出現(xiàn)大量蛋白質樣紅染顆粒，嚴重時腎小管上皮細胞核碎裂、染色質邊移，甚至整個細胞完全碎裂，腎小管結構完全崩解(→)(圖3-H)。腸道病變以腸上皮細胞核染色質邊移為主要特征，腸絨毛黏液細胞明顯增多；腸上皮細胞腫脹、壞死，脫落甚至填滿了腸絨毛間的間隙(圖3-J)。肌纖維輕度水腫、間隙增寬，周圍可見呈條索狀分布的藍紫色細菌；嚴重區(qū)域肌纖維溶解、斷裂，肌漿凝固性壞死，壞死組織中可見淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，同時脂肪細胞出現(xiàn)炎癥(圖3-L)。

3 討論

3.1 魚類感染殺鮭氣單胞菌的臨床癥狀

殺鮭氣單胞菌是養(yǎng)殖鮭鱒最重要的一種病原菌，病魚通常表現(xiàn)為體側或尾部形成特征性膿腫，嚴重時膿腫部位潰爛形成潰瘍[22]。非鮭鱒魚類感染殺鮭氣單胞菌可引起局部感染，嚴重時引起皮膚潰瘍，稱為“非典型”癤瘡病[23]。呂俊超等[20]報道的感染殺鮭氣單胞菌無色亞種的大菱鲆僅出現(xiàn)了口周圍皮膚皮下出血的癥狀，而本研究中患病大菱鲆的“癤瘡”癥狀主要表現(xiàn)為背部肌肉出現(xiàn)串珠狀隆起甚至連成一片，且隆起的肌肉組織發(fā)白，這種癥狀與之前報道的大菱鲆癤瘡病有明顯差異。

3.2 殺鮭氣單胞菌的致病機理

Farto等[24]研究發(fā)現(xiàn)，感染殺鮭氣單胞菌亞種的鮭12 h后，細菌即可侵入大菱鲆的鰓、腸道、肝臟和腎臟，并在感染后期侵入肌肉組織，且細菌在組織中持續(xù)存在并導致大菱鲆死亡。而Bj?rnsdóttir等[25]用殺鮭氣單胞菌無色亞種人工感染大菱鲆后則在大菱鲆鰓組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)藍紫色細菌團塊。本研究中在患病大菱鲆的鰓、肝、脾、腎等組織中同樣觀察到大量藍紫色的細菌團塊，這種現(xiàn)象與殺鮭氣單胞菌無色亞種無運動性的特點有關[26]。菌株只能在侵染的部位分裂增殖，繼而形成藍紫色的細菌團塊。在鰓組織中的細菌團塊堵塞了鰓小片毛細血管，形成栓塞，進而導致鰓組織血液循環(huán)障礙、擴張淤血甚至破裂出血，影響大菱鲆的呼吸功能。魚類的腎臟和脾臟是重要的免疫器官，魚類腎臟可有效抵御外界病原的入侵，脾臟則可為魚體提供充足的血液和免疫細胞[27]。呂俊超等[20]研究僅發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌無色亞種可引起大菱鲆腎小管上皮細胞水樣變性并與周圍組織分離，脾臟中紅髓和白髓界限不清等病理變化，而本研究中觀察發(fā)現(xiàn)，患病大菱鲆的腎臟、脾臟內(nèi)有大量藍紫色細菌團塊，呈多發(fā)性灶性壞死，且部分壞死組織溶解液化，可見免疫器官受損致使細菌在病魚體內(nèi)迅速擴散，從而造成魚體嚴重損傷甚至死亡。

3.3 殺鮭氣單胞菌感染的藥物治療

本研究中從患病大菱鲆體內(nèi)分離純化得到菌株DLPJC01，與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[26]中標準菌株相比，缺乏利用半乳糖、乙酰氨基葡萄糖作為碳源的能力，而具有V.P反應和利用纖維二糖、D-甘露醇的能力。在Pedersen等[28]的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)了一些生理生化指標與標準菌株不同的“非典型”殺鮭氣單胞菌，說明這種“非典型”殺鮭氣單胞菌的情況普遍存在。這可能是分離株生存環(huán)境、宿主的自身特性引起的，也可能與該菌的致病力有關。藥敏試驗結果顯示，該菌株對復方新諾明在內(nèi)的13種抗菌藥物完全不敏感，這表明養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了濫用抗菌藥物的現(xiàn)象。2016年“多寶魚藥物殘留事件”給大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)蒙上了一層陰影，因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)中不能盲目用藥、濫用藥，而應該在藥敏試驗結果的指導下進行針對性治療。