史東杰，胡金有，李文通，姜巨峰，朱華*，王賽賽，陳曉璇，張欣

(1.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所暨國家淡水漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，北京 100068； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083； 3.天津市水產(chǎn)研究所暨天津市觀賞魚技術(shù)工程中心，天津 300221； 4.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300380)

益生菌一詞來源于古希臘文Probiotics，被譯為“共生”之意，與抗生素相對立，在動物體生命維持上可起到相互補益的作用[1-2]。1986年，Kozasa[3]首次將益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，將分離出來的東洋芽孢桿菌Bacillustoyoi應(yīng)用于日本鰻鱺Anguillajaponica養(yǎng)殖中，認為其可增強日本鰻鱺抵抗愛德華氏菌Edwardsiella的能力。1988年，F(xiàn)uller將益生菌定義為“通過改善腸道微生物平衡，有益地影響宿主動物的活的微生物飼料添加劑”[4]。此后，隨著微生物學(xué)的不斷發(fā)展，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到了廣泛應(yīng)用，并表現(xiàn)出了較好的應(yīng)用效果[5-6]。眾多研究表明，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有如下功能：(1)益生菌可調(diào)控水質(zhì)，如枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis制劑可使羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii養(yǎng)殖池塘水中氨氮和亞硝酸態(tài)氮的降解率達到59.61%、86.70%[7]，復(fù)合益生菌可有效降低草魚Ctenopharynodonidellus養(yǎng)殖池塘水體中硝酸鹽和無機氮含量[8]；(2)益生菌可促進動物生長，如枯草芽孢桿菌能促進草魚對飼料的吸收能力，提高生長性能[9]，微生態(tài)制劑可顯著提高錦鯉CyprinuscarpioL.的生長性能[10]；(3)益生菌能提高機體免疫力，如飼料中添加嗜酸乳酸桿菌Lactobacillusacidophilus可有效增強斑馬魚Daniorerio抵抗致病菌的能力[11]，芽孢桿菌Bacillus可顯著提高斑節(jié)對蝦Penaeusmonodon細胞、體液的免疫力[12]；(4)益生菌可調(diào)節(jié)腸道菌群，如復(fù)合益生菌可使大菱鲆Scophthalmusmaximus[13]、鯽Carassiusauratus[14]和異育銀鯽Carassiusauratusgibelio[15]腸道中有益菌數(shù)量增加、有害菌數(shù)量降低，可改善和平衡腸道菌群，促進個體發(fā)育；(5)益生菌可抑制有害微生物生長，可通過降低腸道中的pH值增強對致病菌的抵抗能力[16-17]，同時，益生菌產(chǎn)生的細菌素具有廣譜抑菌作用[18]。

綜上，益生菌在水產(chǎn)領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用，但目前有關(guān)益生菌對魚類親本繁殖力影響的研究尚不多見。近年來，隨著人們生活水平的提高，觀賞魚產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，錦鯉作為觀賞魚中的“寶石”品種，備受市場歡迎，越來越多的人開始從事錦鯉人工養(yǎng)殖。用常規(guī)培育方法培育親魚，其產(chǎn)卵量每年起伏較大。有報道顯示，益生菌在畜禽養(yǎng)殖中可顯著提高母體的繁殖性能[19-20]。為此，本研究中考察了飼料中添加復(fù)合益生菌對錦鯉親魚性腺脂肪酸組成、繁殖力及初孵仔魚成活率的影響，旨在為益生菌在錦鯉的人工繁殖、苗種培育中的應(yīng)用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚取自北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所小湯山良種繁育中心自行培育的3齡紅白錦鯉親魚，600尾親魚(雌雄各300尾)體質(zhì)健壯、品種特征明顯。雌魚體質(zhì)量為(2649.0±257.5)g，雄魚體質(zhì)量為(2349.0±283.9)g。

枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、丁酸梭菌Clostridiumbutyricum和糞腸球菌Enterococcusfaecalis菌株號分別為2018070601、2017121302和2018042501，由漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點試驗室從健康錦鯉消化道中分離得到，純化后進行發(fā)酵培養(yǎng)，并收集菌體，測定菌液濃度，活菌量分別達到了109cfu/mL。依據(jù)其他學(xué)者研究結(jié)論并綜合考慮后，將枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌、糞腸球菌菌數(shù)按1∶1∶1、1∶1∶5、2∶3∶3、4∶2∶3共4種比例進行復(fù)配，因3種菌的活菌量一致，將菌數(shù)比轉(zhuǎn)化為體積比進行復(fù)配，復(fù)配后活菌量仍為109cfu/mL。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 試驗魚暫養(yǎng)于小型循環(huán)水養(yǎng)殖池(3.2 m×1.8 m×1.5 m)中，水深為1.2 m。養(yǎng)殖用水為地下井水，水溫為(24±2)℃，pH為7.4～7.8，溶解氧≥5 mg/L，光照為自然光源。每日投喂兩次(9:30～10:00、17:00～17:30)，日投喂量為魚體質(zhì)量的3%～4%，根據(jù)魚體的攝食情況做適當(dāng)調(diào)整。3～5 d換水一次，不間斷充氣，暫養(yǎng)7 d，正式試驗周期90 d。

1.2.2 試驗飼料的制備 試驗用基礎(chǔ)飼料購于北京三友創(chuàng)美飼料科技有限公司。錦鯉親魚培育期間，基礎(chǔ)飼料營養(yǎng)成分為粗蛋白質(zhì)40.3%、粗脂肪21.6%、粗灰分10.4%、水分4.7%。取4種復(fù)配菌液分別噴灑到飼料中，晾干，使飼料中含菌總量達到109cfu/mg，從而制得枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌、糞腸球菌菌落數(shù)比例分別為1∶1∶1(A)、1∶1∶5(B)、2∶3∶3(C)、4∶2∶3(D)的4種復(fù)合益生菌飼料。菌液和飼料于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩６ㄆ跈z測飼料中菌含量是否合格(菌含量達到109cfu/mg視為合格)。

1.2.3 試驗設(shè)計及人工繁育 錦鯉暫養(yǎng)7 d后，隨機將600尾魚平均分配到15個養(yǎng)殖池(11.8 m×5.4 m×1.5 m)中，其他養(yǎng)殖條件同暫養(yǎng)期，每個養(yǎng)殖池由中間隔網(wǎng)分開為兩個養(yǎng)殖池(a、b)，a池中養(yǎng)殖雌魚、b池中養(yǎng)殖雄魚。試驗共分A組、B組、C組、D組和E組(對照組)，分別飼喂制備的4種比例的復(fù)合益生菌飼料，對照組投喂不添加益生菌的基礎(chǔ)飼料，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)40尾魚，雌雄比例為1∶1。

待雌雄親魚發(fā)情后，從每個養(yǎng)殖池隨機選取的20尾雌魚與同組隨機選擇的雄魚進行人工繁殖，雌雄比例為1∶1，將受精卵均勻鋪在孵化網(wǎng)片上進行孵化，孵化溫度為(25±0.5)℃，及時清除發(fā)白的魚卵。仔魚5～7 d后可平游，7 d內(nèi)投喂蛋黃、輪蟲、小型枝角類等餌料，7 d后投喂配合飼料，配合飼料購自北京三友創(chuàng)美飼料科技股份有限公司，營養(yǎng)成分為粗蛋白質(zhì)41.8%、粗脂肪19.7%、粗灰分8.4%、水分3.2%，配合飼料中不添加復(fù)合益生菌。

1.2.4 樣品采集與分析 養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，禁食24 h，測量每池試驗魚體質(zhì)量。每池隨機選取雌、雄魚各5尾，用MS-222(濃度為0.1 g/L)麻醉后進行解剖，稱取每尾魚性腺質(zhì)量，并統(tǒng)計雌魚卵粒數(shù)。雌魚性腺于-20 ℃保存，用于脂肪酸組成分析。待仔魚孵化出膜后，移出孵化網(wǎng)片，并統(tǒng)計初孵仔魚數(shù)量。對5、10、15、20、25、30 d內(nèi)仔魚的存活率進行計算。

1.2.5 指標測定與計算 飼料與錦鯉性腺的脂肪酸組成參照《GB 5009.168—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》進行測定。統(tǒng)計卵粒數(shù)采用《GB/T 32758—2016 海水魚類魚卵、苗種計數(shù)方法》中的容量計數(shù)法。

錦鯉的成熟系數(shù)及繁殖力相關(guān)計算公式為

成熟系數(shù)=性腺質(zhì)量(g)/魚質(zhì)量(g)×100%，

絕對繁殖力(粒)=單位質(zhì)量卵巢的卵粒數(shù)(粒/g)×卵巢質(zhì)量(g)，

體質(zhì)量相對繁殖力(粒/g)=絕對繁殖力(粒)/雌魚體質(zhì)量(g)，

絕對產(chǎn)卵量(粒/ind.)=每尾雌魚實際產(chǎn)卵數(shù)量(粒/ind.)，

相對產(chǎn)卵量(粒/g)=絕對產(chǎn)卵量(粒)/雌魚體質(zhì)量(g)，

受精率=受精卵數(shù)量(粒)/總卵數(shù)量(粒)×100%，

孵化率=初孵仔魚數(shù)量(ind.)/受精卵數(shù)量(粒)×100%，

存活率=存活數(shù)量(ind.)/總數(shù)量(ind.)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 錦鯉性腺脂肪酸組成的變化

從表1可見：投喂復(fù)合益生菌飼料的試驗組雌魚性腺中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、C18∶1n-9、C18∶2n-6及C18∶3n-3含量均高于對照組，其中B組含量最高，且B組雌魚性腺中多不飽和脂肪酸總量、EPA、DHA含量顯著高于對照組(P<0.05)，而n-6系列多不飽和脂肪酸含量則低于對照組。

表1 投喂含有不同比例枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌、糞腸球菌的復(fù)合益生菌飼料對錦鯉卵巢各類脂肪酸組成的影響Tab.1 Effects of compound probiotic diets containing Bacillus subtilis， Clostridium butyricum and Enterococcus faecalis in different proportions on fatty acid composition in ovary of koi carp %

2.2 錦鯉親魚繁殖力的變化

從表2、表3可見，投喂復(fù)合益生菌飼料的試驗組及對照組雌、雄魚的存活率均為100%。從表2可見，各益生菌組雌魚的性成熟系數(shù)、繁殖力、體質(zhì)量均高于對照組，其中B組最高，B組雌魚性成熟系數(shù)、繁殖力顯著高于對照組(P<0.05)，B、D組絕對繁殖力和體質(zhì)量相對繁殖力均顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 投喂含復(fù)合益生菌飼料對錦鯉雌魚性成熟度和繁殖力的影響Tab.2 Effects of compound probiotic diets in different proportions on maturity and fecundity of female koi carp

從表3可見，各益生菌組雄魚的體質(zhì)量和性成熟系數(shù)均高于對照組，其中B組均最高，僅B組雄魚體質(zhì)量顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 投喂含復(fù)合益生菌飼料對錦鯉雄魚性成熟度的影響Tab.3 Effects of compound probiotic diets in different proportions on maturity of male koi carp

2.3 錦鯉孵化及仔魚成活情況

從表4可見：雌、雄親魚配組后，投喂復(fù)合益生菌飼料的試驗組產(chǎn)卵量、受精率、孵化率和各時期仔魚存活率均高于對照組，其中B組最高且顯著高于對照組(P<0.05)；隨著孵化時間的延長，各組仔魚存活率整體呈先升高后降低再升高變化趨勢，孵化20 d內(nèi)存活率最低。

表4 投喂含復(fù)合益生菌飼料對錦鯉孵化和初孵仔魚存活的影響Tab.4 Effects of compound probiotic diets in different proportions on hatching and survival of newly hatched larvae in koi carp

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌對錦鯉性腺脂肪酸組成的影響

脂類是魚類性腺和胚胎發(fā)育的主要代謝能源，受精卵中的脂類和脂肪酸相對含量在胚胎發(fā)育和初孵仔魚存活期間具有重要作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)，DHA、EPA對魚類繁殖具有重要作用[22]。本研究中，投喂含復(fù)合益生菌飼料的B組雌魚性腺中EPA、DHA含量顯著高于對照組，說明復(fù)合益生菌(枯草芽孢桿菌∶丁酸梭菌∶糞腸球菌=1∶1∶5)可顯著增強錦鯉的性腺發(fā)育。從B組的益生菌配比來看，糞腸球菌含量高于其他試驗組的復(fù)配比例，推測糞腸球菌對錦鯉性腺發(fā)育過程中EPA、DHA含量的增加具有重要作用，但這一推測還需要進一步的試驗證實。本研究還發(fā)現(xiàn)，各試驗組錦鯉雌魚性腺脂肪酸中油酸和亞油酸含量與對照組相比有所提高，此結(jié)果可參照郭盼等[23]研究不同鏈長脂肪酸對斑馬魚性腺脂肪酸組成時的觀點解釋，說明各試驗組復(fù)合益生菌能夠促進錦鯉性腺脂肪酸中油酸和亞油酸的氧化，同時也有研究證明，EPA、DHA的增加可促進組織器官部分脂肪酸的氧化利用[24]。

3.2 復(fù)合益生菌對錦鯉親魚繁殖力的影響

錦鯉繁殖力的高低對魚苗產(chǎn)量至關(guān)重要。雌性親魚絕對繁殖力和相對繁殖力是衡量魚體繁殖狀況的兩個重要指標，性成熟系數(shù)則是評價親魚性腺發(fā)育情況的直接指標之一[25]。目前，益生菌在提高畜禽動物繁殖性能方面的研究較多，而在提高水產(chǎn)動物繁殖狀況方面的研究尚缺乏。本研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和糞腸球菌3株菌復(fù)合制劑復(fù)配飼料可增強錦鯉雌、雄親魚繁殖力，各組雌魚的性成熟系數(shù)、絕對繁殖力和體質(zhì)量相對繁殖力均高于對照組，其中B組(枯草芽孢桿菌∶丁酸梭菌∶糞腸球菌=1∶1∶5)各項指標高于其他組。這可能是由于益生菌通過調(diào)節(jié)魚體腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，提高免疫力，促進性腺發(fā)育，從而提高了魚體繁殖力。這與益生菌在畜禽方面的研究結(jié)果一致。如在日糧中添加復(fù)合益生菌可顯著提高妊娠母豬的健康度、增強采食量，并可提高仔豬的健康指標[20]，也可顯著增加產(chǎn)后14 d母豬飼料消耗量，同時顯著減少哺乳期母豬體質(zhì)量損失[25]。

3.3 復(fù)合益生菌對錦鯉孵化和仔魚存活的影響

絕對懷卵量、相對懷卵量、受精率、孵化率和仔魚存活率是評價雌魚繁殖性能的重要指標[26]。本研究中發(fā)現(xiàn)，各益生菌組孵化率和各時期仔魚的存活率均高于對照組，其中B組(枯草芽孢桿菌∶丁酸梭菌∶糞腸球菌=1∶1∶5)、C組(2∶3∶3)各項指標均高于其他組，尤以B組最高。這表明飼料中復(fù)合益生菌的添加可提高錦鯉仔魚的產(chǎn)量與成活率，這可能與親魚攝入益生菌影響子代菌群結(jié)構(gòu)，從而改善子代脂代謝，促進子代健康有關(guān)。同時，這與Schultz等[27]、關(guān)懷等[28]的研究結(jié)果相一致。Schultz等[27]研究顯示，妊娠期母親服用益生菌，在胎兒出生后2年內(nèi)于糞便樣本中仍能夠檢測到益生菌。關(guān)懷等[28]研究表明，益生菌干預(yù)母親有利于改善肥胖孕鼠子代菌群紊亂及脂代謝異常，促進子代健康。