張新東　趙甜甜　馬靜

[摘要] 目的 探討Stathmin、P16、P63、Ki-67在子宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變（CIN）中的表達(dá)及意義。 方法 收集2017年6月～2018年6月間在我院宮頸活檢及利普刀錐切標(biāo)本396例，其中慢性宮頸炎標(biāo)本74例作為對照組，CINⅠ級標(biāo)本113例、CINⅡ級標(biāo)本122例、CINⅢ級標(biāo)本87例作為觀察組。采用免疫組化（IHC）檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67的表達(dá)情況。 結(jié)果 Stathmin蛋白在慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ的表達(dá)分別為5.41%（4/74）、15.93%（18/113）、38.53%（47/122）、88.51%（77/87），其中觀察組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。P16蛋白在對照組和觀察組的表達(dá)分別為12.16%（9/74）、85.84%（97/113）、100.00%（122/122）、100.00%（87/87），觀察組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。P63蛋白在對照組和觀察組的表達(dá)分別為6.76%（5/74）、66.37%（75/113）、97.54%（119/122）、100.00%（87/87），觀察組分別與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），Ki-67在對照組和觀察組的表達(dá)分別為24.32%（18/74）、75.22%（85/113）、100.00%（122/122）、100.00%（87/87），觀察組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 聯(lián)合檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67有助于鑒別宮頸的良性病變和宮頸上皮內(nèi)瘤變，并可區(qū)分宮頸上皮內(nèi)瘤變的低度病變和高度病變，以準(zhǔn)確指導(dǎo)臨床治療。

[關(guān)鍵詞] Stathmin;P16;P63;Ki-67;宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變

[中圖分類號] R737.3 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）23-0140-05

Expression and significance of Stathmin， P16， P63， Ki-67 in cervical intraepithelial neoplasia

ZHANG Xindong ? ZHAO Tiantian ? MA Jing

Department of Pathology， Tengzhou Central People's Hospital in Shandong Province， Tengzhou ? 277500， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of Stathmin， P16， P63， Ki-67 in cervical squamous intraepithelial neoplasia（CIN）. ?Methods 396 cases of cervical biopsy and lip knife cone cutting specimens were collected in our hospital from June 2017 to June 2018， including 74 cases of chronic cervicitis specimens as a control group， 113 cases of CIN I grade specimens， 122 cases of CIN II grade specimens， 87 cases of CIN Ⅲ specimens were used as an observation group. Immunohistochemistry（IHC） was used to detect the expression of Stathmin， P16， P63 and Ki-67. Results The expression of Stathmin protein in chronic cervicitis， CINⅠ， CINⅡ， and CINⅢ was 5.41%（4/74）， 15.93%（18/113）， 38.53%（47/122）， and 88.51%（77/87）， and there were statistically significant differences between the observation group and control group（P<0.01）. There were statistically significant differences in the expression of P16 protein between the observation group[12.16%（9/74）] and the observation group[85.84%（97/113）， 100.00%（122/122）， and 100.00%（87/87）]（P<0.01）. There were statistically significant differences in the expression of P63 protein between the control group [6.76%（5/74）] and the observation group [66.37%（75/113）， 97.54%（119/122）， and 100.00%（87/87）， respectively]（P<0.01）. The expression of Ki-67 was 24.32%（18/74） in the control group， 75.22%（85/113）， 100.00%（122/122）， and 100.00%（87/87） in the observation group， and the difference between the two groups was statistically significant（P<0.01）. Conclusion The joint detection of Stathmin， P16， P63 and Ki-67 is helpful to identify benign cervical lesions and cervical intraepithelial neoplasia， and can distinguish between low-grade and high-grade cervical intraepithelial neoplasia to accurately guide clinical treatment.

[Key words] Stathmin; P16; P63; Ki-67; Cervical squamous intraepithelial neoplasia

子宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，是威脅女性健康和生命的主要惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率有所增加，且有年輕化趨勢。與宮頸浸潤癌密切相關(guān)的癌前病變的是宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN），是與子宮頸癌有緊密聯(lián)系的一組癌前病變的統(tǒng)稱[1]，它包括了宮頸低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變（Low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）和宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變（High-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL），LSIL包括濕疣及CINⅠ，HSIL包括了CINⅡ和CINⅢ。LSIL大部分可自然消退，僅少數(shù)繼續(xù)可進(jìn)展為HSIL和浸潤癌，而大部分HSIL具有癌變潛能，并且兩者的治療方案也完全不同，因此準(zhǔn)確區(qū)分LSIL和HSIL具有至關(guān)重要的臨床意義。當(dāng)宮頸上皮病變組織出現(xiàn)如反應(yīng)性鱗狀上皮增生、基底細(xì)胞增生、不成熟鱗狀上皮化生、移行上皮化生和萎縮等情況時(shí)，病理醫(yī)師有可能受自身主觀因素的影響，在病理診斷結(jié)果上會(huì)有很大程度上的偏差，這時(shí)會(huì)致臨床漏診、誤診造成錯(cuò)誤治療。因此，為了提高CIN診斷的準(zhǔn)確性，使用有效的生物學(xué)標(biāo)記物為組織病理學(xué)診斷提供客觀依據(jù)就顯得尤為重要[2-5]。本研究采用免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）方法聯(lián)合檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67在宮頸鱗狀上皮病變中的表達(dá)，探討其差異性及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集滕州市中心人民醫(yī)院病理科2017年6月～2018年6月間宮頸活檢及錐切標(biāo)本396例，其中慢性宮頸炎標(biāo)本74例作為對照組，年齡21～78歲，平均40.5歲。觀察組包括CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級，總共322例。CINⅠ級標(biāo)本113例，年齡21～69歲，平均年齡38.1歲;CINⅡ級標(biāo)本122例，年齡24～70歲，平均39.7歲;CINⅢ級標(biāo)本87例，年齡25～66歲，平均44.1歲。所有的病理切片均由兩名高年資病理醫(yī)師共同閱片確診。各組年齡比較均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），具有可比性。本研究所涉及的相關(guān)病理檢測符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 方法

396例宮頸活檢及錐切標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，全自動(dòng)脫水機(jī)（Leica ASP300S）脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光鏡觀察。采用全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)（LEICA BOND-MAX）進(jìn)行免疫組化檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67的表達(dá)，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗做陰性對照染色。

1.3 試劑

兔抗人Stathmin單克隆抗體（克隆號：SP49）、鼠抗人P16單克隆抗體（克隆號：MX007）、鼠抗人P63單克隆抗體（克隆號：MX008）、鼠抗人Ki-67單克隆抗體（克隆號：MX006），以上試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.4 免疫組化結(jié)果判定[6]

陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：用光學(xué)顯微鏡觀察顯色反應(yīng)，在高倍鏡下（×400）對每一張切片隨機(jī)選擇具有代表性的5個(gè)視野， 并且每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，總共計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，然后計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比。（1）Stathmin以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見到棕黃色顆粒為陽性。（2）P16以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。（3）P63以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒陽性。（4）Ki-67以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒陽性。（5）按照陽性細(xì)胞百分比的多少分4級：無陽性細(xì)胞（-）為0～10%，弱陽性（+）為10%～25%，中度陽性（++），25%50%，>50%強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad 6.0軟件對所有數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，陽性率值計(jì)算為各組陽性表達(dá)例數(shù)比總例數(shù)的值，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Stathmin、P16、P63、Ki-67在各組子宮頸病變標(biāo)本中的表達(dá)情況

統(tǒng)計(jì)結(jié)果所示，Stathmin、P16、P63、Ki-67蛋白在慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級和CINⅢ級組織中的陽性率表達(dá)是逐漸增高的，并且三組觀察組的陽性率都高于對照組。見表1。

2.2 Stathmin蛋白表達(dá)在各組間比較

Stathmin的表達(dá)定位在細(xì)胞質(zhì)（封三圖9）;結(jié)果顯示Stathmin在慢性宮頸炎組的陽性表達(dá)率明顯低于三組觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CINⅠ級組陽性表達(dá)率明顯低于CINⅡ級組和CINⅢ級組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 P16蛋白表達(dá)在各組間比較

P16蛋白的表達(dá)定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)（封三圖10）;結(jié)果顯示P16在慢性宮頸炎組的陽性表達(dá)率明顯低于三組觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CINⅠ級組陽性表達(dá)率明顯低于CINⅡ級組和CINⅢ級組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 P63蛋白表達(dá)在各組間比較

P63蛋白的表達(dá)定位在細(xì)胞核（封三圖11）;結(jié)果顯示P63在慢性宮頸炎組的陽性表達(dá)率明顯低于三組觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CINⅠ級組陽性表達(dá)率明顯低于CINⅡ級組和CINⅢ級組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

2.5 Ki-67蛋白表達(dá)在各組間比較

Ki-67蛋白的表達(dá)定位在細(xì)胞核（封三圖12）;結(jié)果顯示Ki-67在慢性宮頸炎組的陽性表達(dá)率明顯低于三組觀察組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CINⅠ級組陽性表達(dá)率明顯低于CINⅡ級組和CINⅢ級組，差異結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

3 討論

CIN是宮頸癌發(fā)生的黃金階段，在篩查宮頸上皮病變時(shí)，如何利用有效的客觀指標(biāo)來評價(jià)各級CIN也是病理醫(yī)師的診斷難點(diǎn)。CIN分級不同，它的治療和預(yù)后也有很大的差異，因此為了明確鑒別CIN級別需借助免疫組織化學(xué)標(biāo)記物來輔助診斷。病理日常工作中常用的抗體是P16、Ki-67，但這兩種抗體標(biāo)記對CIN的診斷仍存在一定的偏差，不可避免出現(xiàn)漏診和誤診。而本研究通過聯(lián)合檢測Stathmin、P16、P63、Ki-67有助于明確CIN級別和提高診斷準(zhǔn)確率，最大程度減少了漏診和誤診。

Stathmin是一種相對分子量為19 KD的蛋白質(zhì)，廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中。它是一種微管相關(guān)蛋白（Microtubule associated protein，MAPs），由于其作用可以促進(jìn)微管的解聚，參與細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，引起細(xì)胞生物學(xué)行為變化，具有癌蛋白的功能[7]，在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及表型決定上的重要作用及意義，可在多種腫瘤中呈高表達(dá)。有研究表明，Stathmin在所有的子宮頸癌和CINⅢ級都是過表達(dá)，而在低級別病變中不表達(dá)或部分表達(dá)。Brooke等研究證實(shí)Stathmin在宮頸上皮內(nèi)瘤變高表達(dá)，且與病變級別相關(guān)[8]。本研究中發(fā)現(xiàn)Stathmin蛋白在LSIL組和HSIL組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CIN組織中Stathmin與P16蛋白表達(dá)有正相關(guān)性，與Howiitt BE等[9]的報(bào)道一致。所以Stathmin協(xié)同P16檢測可提高宮頸上皮內(nèi)病變的分級準(zhǔn)確率。

P16是一種重要的抑癌基因，它位于人類染色體9P21，它參與了細(xì)胞周期的調(diào)控。P16蛋白通過抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶4（Cdk4）的活性，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。它一旦失活會(huì)導(dǎo)致惡性增殖，在判斷良性宮頸病變、CIN中有十分重要的臨床意義[10]。國內(nèi)外研究表明，P16是檢測子宮頸癌前病變的一個(gè)有效指標(biāo)，許多實(shí)驗(yàn)也支持P16在宮頸HSIL中的診斷價(jià)值[11，12]，但P16一般與具有人乳頭瘤病毒（HPV）感染所致的CIN病變有更為密切的關(guān)系，用P16來代替高危HPV檢測的敏感性和特異性達(dá)到80%以上[13-15]。P16的表達(dá)隨著宮頸病變的級別上升而表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，是宮頸上皮內(nèi)瘤變病理診斷的很好的補(bǔ)充[16]。本研究結(jié)果顯示，CIN組中P16陽性表達(dá)率明顯高于正常對照組，P16在宮頸CINⅡ及CINⅢ組陽性表達(dá)率明顯高于宮頸CINⅠ組，表明P16可以有效提高對早期宮頸病變進(jìn)展的預(yù)測效果，從而可以對這部分患者進(jìn)行密切監(jiān)測及早期干預(yù)治療。

P63是近年來發(fā)現(xiàn)的P53基因家族新成員，定位于染色體3q27～3q28，是一種核蛋白，與抑癌基因P53具有同源性的基因編碼，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及細(xì)胞凋亡過程。陳瑋等[17]研究證實(shí)P63在正常子宮頸鱗狀上皮呈陰性表達(dá)，鱗狀上皮增生可呈陽性表達(dá)，P63陽性表達(dá)強(qiáng)度隨CIN級別增高而顯著升高。本研究結(jié)果顯示，P63在CIN表達(dá)陽性率高于正常組織，提示P63隨著宮頸病變的進(jìn)展其陽性表達(dá)率顯著上升，與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相同[18]。

Ki-67是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志物，存在于細(xì)胞周期中除G0期以外的所有階段。Ki-67蛋白在鑒別慢性宮頸炎、高低級別CIN及宮頸癌中有較大的意義，研究認(rèn)為Ki-67蛋白與宮頸病變的嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為鑒別診斷的指標(biāo)[19]。徐濤等[20]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CIN組中陽性率隨CIN級別升高而升高，在宮頸癌組織中的表達(dá)最強(qiáng)。Lorenzato M等[21]研究顯示子宮頸上皮的上2/3發(fā)現(xiàn)Ki-67陽性表達(dá)可作為鑒別LSIL、HSIL的標(biāo)志。本研究顯示，Ki-67陽性表達(dá)在慢性宮頸炎及CIN中差異顯著，且陽性程度隨CIN級別的升高而升高，提示宮頸上皮病變的過程是細(xì)胞增殖逐漸活躍的過程，Ki-67陽性表達(dá)程度對CIN分級的診斷有提示作用。但由于Ki-67存在于增殖的細(xì)胞中，部分炎性疾病和CINⅠ級宮頸組織中的也可見Ki-67陽性表達(dá)，因此在鑒別子宮頸上皮內(nèi)瘤變時(shí)最好與其它指標(biāo)聯(lián)合，國內(nèi)經(jīng)常把P16、Ki-67聯(lián)合使用，作為判斷子宮頸良性病變與CIN的客觀指標(biāo)。崔凱等[22]研究顯示，檢測p16蛋白及Ki-67抗原的表達(dá)對CIN的分級診斷具有較高的價(jià)值。

綜上所述，CIN是多基因、多因素共同作用的結(jié)果，準(zhǔn)確、客觀地診斷CIN及其分級對臨床進(jìn)一步治療和預(yù)后評價(jià)是非常重要的。盡管區(qū)分LSIL和HSIL非常重要，但組織形態(tài)學(xué)上兩者是連續(xù)的病變，并沒有一個(gè)截然的分界線，本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測Stathmin、P16、P63和Ki-67，可以區(qū)分HSIL與LSIL和良性反應(yīng)性改變，在一定程度上盡可能的避免不同病理醫(yī)師對CIN進(jìn)行診斷時(shí)出現(xiàn)可重復(fù)性差的問題，使CIN分級更加精確，使診斷更加客觀，為臨床治療提供確實(shí)有效的病理診斷依據(jù)，減少了誤診造成的錯(cuò)誤治療，有效減輕了患者的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，對有效預(yù)防子宮頸癌的發(fā)生和早期治療具有重要意義。

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（收稿日期：2020-04-08）