樊麗超　朱雅娟　曹宏麗

[摘要] 目的 評價三種快速實驗室檢測技術(shù)對兒童結(jié)核性腦膜炎的早期診斷價值。 方法 收集沈陽市胸科醫(yī)院2017年6月～2019年12月收治的疑診兒童結(jié)核性腦膜炎病例52例，分別進(jìn)行血T-SPOT.TB、腦脊液LAMP和腦脊液Xpert MTB/RIF檢測。結(jié)果采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算三種檢測方法在診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致率。 結(jié)果 在52例患者中，血T-SPOT.TB診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度為93.75%，特異度8.33%，陽性預(yù)測值31.25%，陰性預(yù)測值75.00%，一致率34.62%。腦脊液LAMP診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度為81.25%，特異度75.00%，陽性預(yù)測值59.09%，陰性預(yù)測值90.00%，一致率76.92%。腦脊液Xpert MTB/RIF診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度為87.50%，特異度88.89%，陽性預(yù)測值77.78%，陰性預(yù)測值94.12%，一致率88.46%。 結(jié)論 血T-Spot、腦脊液LAMP和腦脊液Xpert MTB/RIF檢測對兒童結(jié)核性腦膜炎的早期診斷具有一定的價值，值得臨床推廣。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核性腦膜炎;早期診斷;結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點試驗;環(huán)介導(dǎo)等溫擴增;Xpert MTB/RIF

[中圖分類號] R52.9.3 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）23-0118-04

The value of three rapid laboratory testing techniques in the early diagnosis of pediatric tuberculous meningitis

FAN Lichao ? ZHU Yajuan ? CAO Hongli

Department of Tuberculosis， Shenyang Tenth People's Hospital， Shenyang Chest Hospital， Shenyang ? 110044， China

[Abstract] Objective To evaluate the value of three rapid laboratory testing techniques for early diagnosis of pediatric tuberculous meningitis. Methods 52 cases of suspected pediatric tuberculous meningitis who were admitted to Shenyang Chest Hospital from June 2017 to December 2019 were collected. Blood T-SPOT.TB， cerebrospinal fluid LAMP and cerebrospinal fluid Xpert MTB/RIF were tested respectively. The results were statistically analyzed using SPSS18.0 software. The sensitivity， specificity， positive predictive value， negative predictive value， and agreement rate of the three detection methods in the diagnosis of tuberculous meningitis were calculated. Results In 52 patients， the sensitivity of blood T-SPOT.TB for diagnosis of tuberculous meningitis was 93.75%， specificity was 8.33%， positive predictive value was 31.25%， negative predictive value was 75.00%， and agreement rate was 34.62%. The sensitivity of cerebrospinal fluid LAMP in the diagnosis of tuberculous meningitis was 81.25%， specificity was 75.00%， positive predictive value was 59.09%， negative predictive value was 90.00%， and agreement rate was 76.92%. The sensitivity of cerebrospinal fluid Xpert MTB/RIF for the diagnosis of tuberculous meningitis was 87.50%， specificity was 88.89%， positive predictive value was 77.78%， negative predictive value was 94.12%， and agreement rate was 88.46%. Conclusion The detection of blood T-Spot， cerebrospinal fluid LAMP and cerebrospinal fluid Xpert MTB/RIF has a certain value for the early diagnosis of pediatric tuberculous meningitis， which is worthy of clinical promotion.

[Key words] Tuberculous meningitis; Early diagnosis; T-lymphocyte spot test for tuberculosis infection; Loop-mediated isothermal amplification; Xpert MTB/RIF

性腦膜炎（Tuberculous menigitis，TBM）是腦膜的非化膿性炎癥，一般為結(jié)核分枝桿菌經(jīng)血液或直接侵入蛛網(wǎng)膜下間隙引起，該病發(fā)病急緩不定，病程長，致殘率和致死率高，是結(jié)核病中最嚴(yán)重的類型[1]。兒童因中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不成熟，細(xì)胞免疫功能低下，是TBM的易感人群，我們在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，兒童患者尤其是低齡患兒很難正確描述病情，配合完成結(jié)核相關(guān)檢查，導(dǎo)致誤診誤治的幾率明顯增高，因此有效的早期診斷方法對改善兒童TBM的預(yù)后至關(guān)重要[2]。

傳統(tǒng)的TBM診斷金標(biāo)準(zhǔn)為腦脊液抗酸染色陽性或腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)陽性，但抗酸染色陽性率極低，結(jié)核菌培養(yǎng)耗時長，對TBM的早期診斷價值有限，因此臨床上急需新的診斷技術(shù)。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗（T-SPOT.TB）是以T細(xì)胞免疫應(yīng)答作為基礎(chǔ)的γ-干擾素釋放試驗，通過檢測結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10特異性效應(yīng)T細(xì)胞，從而用于結(jié)核桿菌的檢測和結(jié)核病的輔助診斷的新技術(shù)，T-SPOT的刺激原ESAT-6及CFP-10抗原基因嚴(yán)格限制于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及4種非結(jié)核分枝桿菌，不存在于卡介苗中，從而避免了傳統(tǒng)結(jié)核桿菌皮試中存在的BCG交叉抗原反應(yīng)，保證了T-SPOT試驗的特異度，目前已廣泛應(yīng)用于臨床[3-4]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是可以檢測結(jié)核分枝桿菌的一種新型的恒溫核酸擴增技術(shù)，具有特異性高、時間短、操作簡單等優(yōu)點，適用于全國各級結(jié)核病實驗室[5]。Xpert MTB/RIF是美國Cepheid公司開發(fā)，以半套式實時定量聚合酶鏈反應(yīng)擴增技術(shù)為基礎(chǔ)，能自動抽提DNA并擴增rpoB基因的診斷平臺，目前在肺結(jié)核的診斷中敏感度和特異度較高，并且可用于腦脊液的檢測[6]，我們對沈陽市胸科醫(yī)院收治的52例兒童TBM患者進(jìn)行了MGIT960培養(yǎng)、血T-SPOT.TB、腦脊液LAMP和腦脊液Xpert MTB/RIF檢測，評價其對兒童TBM的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取沈陽市胸科醫(yī)院2017年6月～2019年12月臨床診斷為TBM的病例52例，年齡1～17歲，其中男29例，女23例，參照第8版《實用兒科學(xué)》，入組病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：（1）有頭痛、惡心嘔吐、發(fā)熱等臨床癥狀。（2）查體有頸強直，腦膜刺激征陽性等表現(xiàn)。（3）腰穿提示高顱壓，腦脊液化驗細(xì)胞數(shù)升高，以淋巴細(xì)胞為主，葡萄糖和氯降低，蛋白升高。（4）頭CT或MRI提示為滲出改變、腦積水、腦膜強化、腦梗死或腦實質(zhì)內(nèi)結(jié)核球改變、胸部X線或CT有原發(fā)肺結(jié)核特征。（5）符合以下各項之一者：最近體重明顯減輕，有與痰涂片陽性的肺結(jié)核家屬密切接觸史，或合并其他顱外結(jié)核病，PPD強陽性，結(jié)核抗體陽性，腦脊液涂片查抗酸桿菌陽性，或PCR TB-DNA陽性。（6）除外其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]。

1.2 方法

1.2.1 腦脊液和血液的采集和檢測 ?所有患者均取入院后第一次腰穿腦脊液3 mL，血液標(biāo)本均為入院后次日晨起空腹靜脈血，標(biāo)本采集前均取得患者監(jiān)護(hù)人同意，簽署用于本次臨床試驗采取標(biāo)本的知情同意書。所有實驗部分均由沈陽市胸科醫(yī)院結(jié)核病實驗室完成。標(biāo)本采集后送檢腦脊液MGIT960培養(yǎng)、血T-SPOT.TB、腦脊液LAMP和腦脊液Xpert MTB/RIF檢測，操作嚴(yán)格按照《結(jié)核病實驗室診斷檢驗規(guī)程》和試劑說明書進(jìn)行操作[8]。

1.2.2 MGIT960培養(yǎng) ?收集患者入院后第一次腰穿腦脊液，經(jīng)4%NaOH溶液處理，取0.1 mL接種于酸性羅氏培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，MGIT960液體培養(yǎng)系統(tǒng)由美國BD公司生產(chǎn)，將腦脊液標(biāo)本按照BACTEClM MGIT生產(chǎn)規(guī)范（MGITlM Procedure Manual）要求進(jìn)行培養(yǎng)[9]。

1.2.3 T-SOPT.TB檢測 ?所有患者均取入院后次日晨起靜脈血4 mL于抗凝管中，混勻后裝入“T”、“N”、“P”三種培養(yǎng)管中，再次混勻5次后于37℃培養(yǎng)約24 h，培養(yǎng)后3000～5000 r/min離心10 min，離心后取上清液加入樣品孔，混勻封板37℃ 60 min后加酶標(biāo)試劑50 μL?；靹蚍獍?7℃放置60 min，洗板5遍，加顯色劑A/B各50 μL，37℃避光顯色15 min，加終止液震蕩均勻，10 min后450 nm檢測[10]。

1.2.4 LAMP檢測 ?將收集的患者腦脊液吸入吸附劑試管中混勻裂解（90℃，5 min）。將吸附管裝到樣本處理管上，搖晃5～10次后提取核酸，加上滴注蓋，輕壓樣本處理管將樣本滴入反應(yīng)管中。充分混合后進(jìn)行LAMP反應(yīng)，于67℃，反應(yīng)40 min，然后放入恒溫?zé)晒夂怂釘U增LF-160的熒光目視檢測單元，通過紫外線激發(fā)熒光觀察反應(yīng)結(jié)果[11]。

1.2.5 Xpert MTB/RIF ?向1 mL腦脊液中加入1 mL樣本處理充分混勻，放置15 min并間斷搖晃，然后用無菌吸管將2 mL液體移入塑料試劑盒中，后者插入Xpert MTB/RIF檢測平臺中，輸入樣品相關(guān)信息后運行儀器會自動進(jìn)行樣品的過濾和洗滌，超聲溶菌釋放出DNA后與PCR反應(yīng)試劑混合，半巢式實時擴增并檢測熒光信號，根據(jù)循環(huán)閾值的高（CT<16）、中（16≤CT≤22）、低（22

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件，計算腦脊液MGIT960培養(yǎng)、血T-SPOT.TB、腦脊液LAMP和腦脊液Xpert MTB/RIF診斷結(jié)核性腦膜炎的陽性率、敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值和一致率。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測方法的檢出情況比較

將52例患者的標(biāo)本進(jìn)行腦脊液MGIT960培養(yǎng)、血T-SPOT.TB、腦脊液LAMP和腦脊液Xpert MTB/RIF檢測，腦脊液MGIT960培養(yǎng)陽性16例（30.77%），血T-Spot陽性48例（92.31%），腦脊液LAMP陽性22例（42.31%），GeneXpert陽性18例（34.62%）。見表1～3。

2.2 三種檢測方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致率

以MGIT960液體培養(yǎng)檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)判斷血T-SPOT.TB診斷TBM的敏感度為93.75%，特異度8.33%，陽性預(yù)測值31.25%，陰性預(yù)測值75.00%，一致率34.62%。腦脊液LAMP診斷TBM的敏感度為81.25%，特異度75.00%，陽性預(yù)測值59.09%，陰性預(yù)測值90.00%，一致率76.92%。腦脊液Xpert MTB/RIF診斷TBM的敏感度為87.50%，特異度88.89%，陽性預(yù)測值77.78%，陰性預(yù)測值94.12%，一致率88.46%（表4）。

3 討論

結(jié)核病是當(dāng)今世界上危害兒童健康的主要傳染病之一，世界衛(wèi)生組織（WHO）報告的數(shù)據(jù)顯示，全球每年有約104萬例的新發(fā)兒童結(jié)核病，占全球新發(fā)結(jié)核病的6.9%[13]。兒童因中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，在感染結(jié)核菌后，極易發(fā)展為中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核，部分兒童TBM的臨床癥狀不典型，病情進(jìn)展迅速，造成較高的致殘率和死亡率，因此兒童TBM的早期診斷和盡早治療至關(guān)重要[14]。目前隨著結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)的發(fā)展，涌現(xiàn)出很多方法用于結(jié)核分枝桿菌的快速診斷，本研究系統(tǒng)評價了血T-SPOT.TB、腦脊液LAMP和腦脊液Xpert MTB/RIF檢測在以腦脊液MGIT960培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)時診斷兒童結(jié)腦的價值。

本研究中血T-SPOT.TB的陽性率92.31%，敏感度為93.75%，特異度8.33%，陽性預(yù)測值31.25%，陰性預(yù)測值75.00%，一致率34.62%。說明T-SPOT.TB可以明顯提高結(jié)腦的檢出率，但需注意假陰性的可能，T-SPOT.TB陽性時需結(jié)合其他臨床資料進(jìn)行綜合判斷，而T-SPOT.TB陰性對于排除診斷意義更大。既往兒童結(jié)核病的診斷主要依靠結(jié)核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST），但TST受機體免疫功能、結(jié)核菌素交叉抗原反應(yīng)和觀察者主觀因素的影響較大，導(dǎo)致敏感度和特異度較差，T-SPOT.TB是通過有效釋放IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞來對結(jié)核分枝桿菌感染情況做出判斷的技術(shù)，由于結(jié)核菌RD1基因在卡介苗和絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的基因組中缺失，因而不受卡介苗及環(huán)境分枝桿菌的影響，也不受免疫功能狀態(tài)的影響，診斷結(jié)核感染敏感性和特異性更高[15]。徐麗丹等[16]研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB對處于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的嬰幼兒或應(yīng)用免疫抑制藥物的患兒仍有較理想的敏感性。因此T-SPOT.TB可以作為兒童TBM的輔助診斷工具，可以有效減少兒童TBM的誤診率和漏診率。

本研究中腦脊液LAMP的陽性率42.31%，明顯高于腦脊液涂片鏡檢和培養(yǎng)，同時本研究以MGIT960培養(yǎng)檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)時LAMP敏感度為81.25%，特異度75.00%，陽性預(yù)測值59.09%，陰性預(yù)測值90.00%，一致率76.92%。體現(xiàn)了LAMP簡單、便捷、敏感度高、特異度高的優(yōu)勢。本研究中有9例MGIT960液體培養(yǎng)陰性而LAMP陽性的病例，考慮可能的原因為：腦脊液載菌量低，送檢標(biāo)本的載菌量遠(yuǎn)低于MGIT960液體培養(yǎng)的檢出限，而LAMP對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的檢出限達(dá)到了10 CFU/mL，遠(yuǎn)高于MGIT960液體培養(yǎng)的檢出限，因此說明在MGIT960液體培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中不一定沒有結(jié)核菌[17]。孫雯雯等[18]報道LAMP存在假陽性可能，考慮的原因為：臨床標(biāo)本在擴增過程中被氣溶膠污染，造成了假陽性。培養(yǎng)法只能對活菌進(jìn)行培養(yǎng)，而LAMP對沒有活性的菌株也可以進(jìn)行擴增，從而造成LAMP檢測陽性而培養(yǎng)法為陰性的情況。

Xpert MTB/RIF檢測痰標(biāo)本用于肺結(jié)核的診斷已得到國際上的認(rèn)可，2014年WHO推薦在兒童疑似結(jié)核病中優(yōu)先采用Xpert MTB/RIF實驗進(jìn)行初篩，目前文獻(xiàn)報道Xpert MTB/RIF對肺結(jié)核診斷總靈敏度為90.4%，總特異性為98.4%，但其對腦脊液、胸腹腔積液、關(guān)節(jié)液和心包積液等不同標(biāo)本的敏感度有較高的異質(zhì)性[19]。在本研究中腦脊液Xpert MTB/RIF的敏感度為87.50%，特異度88.89%，陽性預(yù)測值77.78%，陰性預(yù)測值94.12%，一致率88.46%。體現(xiàn)了其對兒童早期TBM的診斷優(yōu)勢，并可同時提供利福平的耐藥情況，為耐藥結(jié)腦的治療提供依據(jù)，因此可推薦在有條件的醫(yī)療機構(gòu)廣泛應(yīng)用。

在本研究中T-SPOT.TB的敏感度最高，可以提高兒童結(jié)腦的診斷率，且不受卡介苗和患者免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的影響，但需要注意假陰性的影響，在兒童TBM患者中的排除診斷意義更大。LAMP設(shè)備簡單，價格低廉，對操作人員技術(shù)要求較低，相對于Xpert MTB/RIF更適合在基層推廣。Xpert MTB/RIF的敏感度和特異度優(yōu)于MGIT960培養(yǎng)，且能提供利福平耐藥情況，但主要的局限性在于Xpert MTB/RIF的技術(shù)設(shè)備價格較高，操作環(huán)境需要維持一定的溫度和濕度，甚至需要空調(diào)來調(diào)節(jié)操作和存儲溫度，因此一定程度上限制了Xpert MTB/RIF推廣應(yīng)用。

上述三種快速實驗室檢測技術(shù)對兒童TBM的診斷具有較高價值，但本研究病例數(shù)較少，存在一定的偏倚，今后仍需擴大樣本量以進(jìn)行更深入的研究。

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（收稿日期：2020-04-14）