吳源 白淑榮 任紅梅 尹彩君 魏述軍

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 1心血管中心，寧夏 銀川 750021；2呼吸科；3心內(nèi)科；4內(nèi)分泌科)

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌疾病，致病因素很多，長(zhǎng)期糖尿病可引起動(dòng)脈硬化、冠心病、高血壓、腎病、足潰瘍等多種慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者生命〔1〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)是位于血管最內(nèi)層的一層細(xì)胞，作為功能異常活躍的內(nèi)分泌器官可合成及分泌大量的血管活性物質(zhì)，維持血管正常生理功能〔2〕。糖尿病血管病變是糖尿病人最常見的并發(fā)癥，是糖尿病致死、致殘的主要原因〔3〕。程序性細(xì)胞死亡因子(PDCD)4是一個(gè)細(xì)胞凋亡因子，可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，位于染色體10q24〔4〕。研究表明，PDCD4蛋白在高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的VEC中上調(diào)表達(dá)，參與高糖誘導(dǎo)的VEC凋亡過程，并影響細(xì)胞的增殖〔5〕。微小RNA(miRNA)是在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類由19～25個(gè)堿基構(gòu)成的內(nèi)源性小分子RNA，通過連接于靶基因mRNA的3′UTR，降解靶基因mRNA或阻止其蛋白翻譯〔6〕。高糖環(huán)境可上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中miRNA-503表達(dá)，通過抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子1的表達(dá)，減少HUVEC的增殖，促進(jìn)其凋亡〔7〕。在血栓素的刺激下，HUVEC中miR-181b的表達(dá)迅速下調(diào)，保護(hù)VEC損傷〔8〕。miR-181b-5p在VEC的研究尚未清楚，因此，本研究采用體外培養(yǎng)人血管臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的方法，探究miR-181b-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC增殖和凋亡的影響及調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 HUVEC購自美國ATCC公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自Gibco公司；葡萄糖購自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司；Trizol試劑、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學(xué)發(fā)光液、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自北京Solarbio公司；放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國Coulter公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購于TaKaRa公司；兔多克隆抗體PDCD4購自美國Bioworld公司；兔多克隆抗體GAPDH、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自Abcam公司；control mimic、miR-181b-5p mimic、control inhibitor、miR-181b-5p inhibitor由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成；pcDNA-PDCD4過表達(dá)載體由金瑞斯生物科技公司構(gòu)建；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃ 5%CO2濕度飽和的條件下培養(yǎng)，每隔24 h換液1次，待細(xì)胞融和至60%～ 70%時(shí)，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，加入胰酶消化并重懸，以1×105個(gè)/孔接種至24孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h。參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-NC組轉(zhuǎn)染control mimic，miR-181b-5p組轉(zhuǎn)染miR-181b-5p mimic，anti-miR-NC組轉(zhuǎn)染control inhibitor，anti-miR-181b-5p組轉(zhuǎn)染miR-181b-5p inhibitor，si-PDCD4組轉(zhuǎn)染PDCD4 siRNA，miR-181b-5p+pcDNA組共轉(zhuǎn)染miR-181b-5p mimic和pcDNA，miR-181b-5p+pcDNA-PDCD4組共轉(zhuǎn)染miR-181b-5p mimic和pcDNA-PDCD4，轉(zhuǎn)染至HUVEC細(xì)胞。之后對(duì)miR-181b-5p組、si-PDCD4組、miR-181b-5p+pcDNA組和miR-181b-5p+pcDNA-PDCD4組給予含33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，標(biāo)記為高糖組。其余用濃度5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞標(biāo)記為對(duì)照組。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè) 取上述各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，Trizol試劑提取各組HUVEC細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA純度和濃度后使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，置于實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用F=2-△△Ct法進(jìn)行結(jié)果分析。以GAPDH作為內(nèi)參，引物如下：GAPDH正義鏈：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH反義鏈：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.5Western印跡檢測(cè) 取上述各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入RIPA裂解液，置于冰上裂解細(xì)胞，4℃，26 750 r/min離心20 min，收集上清。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入PDCD4抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌；電化學(xué)發(fā)光顯影，每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取上述各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其制備成1×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液后，每孔100 μl接種至96孔板中，培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度條件下。在各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)加入20 μl(5 g/ L)的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩使結(jié)晶溶解，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度值(OD)。細(xì)胞活性與吸光值呈正比。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取上述各組細(xì)胞，加入預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106個(gè)/ml，使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒依次加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) Targetscan在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PDCD4 3′-非翻譯區(qū)(UTR)上存在miR-181b-5p的結(jié)合位點(diǎn)，為進(jìn)一步驗(yàn)證PDCD4是否是miR-181b-5p的靶基因，按照LipofectamineTM2000使用說明書，將野生型PDCD4表達(dá)載體(3′-UTR-WT)和突變型PDCD4表達(dá)載體(3′-UTR-MUT)分別與miR-181b-5p mimic共轉(zhuǎn)染至HUVEC細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)熒光素酶活性，相對(duì)熒光強(qiáng)度=螢火蟲熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1高糖對(duì)HUVEC增殖和凋亡的影響 與對(duì)照組相比，高糖組HUVEC在培養(yǎng)至48 h、72 h時(shí)活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01、P<0.001)。見表1。

表1 高糖對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間HUVEC增殖和凋亡的影響

2.2高糖對(duì)HUVEC中miR-181b-5p和PDCD4蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，高糖組的miR-181b-5p呈顯著低表達(dá)，PDCD4 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 高糖對(duì)HUVEC中PDCD4蛋白表達(dá)的影響

表2 高糖對(duì)HUVEC中miR-181b-5p和PDCD4蛋白表達(dá)的影響

2.3過表達(dá)miR-181b-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC增殖、凋亡的影響 與高糖組相比，高糖+miR-181b-5p組miR-181b-5p的表達(dá)量顯著升高(P<0.001)，HUVEC在培養(yǎng)至48 h和72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著增加(P<0.05,P<0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 過表達(dá)miR-181b-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的培養(yǎng)不同時(shí)間HUVEC增殖、凋亡的影響

2.4抑制PDCD4蛋白表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC增殖、凋亡的影響 與高糖組相比，高糖+si-PDCD4組的PDCD4蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，48 h、72 h HUVEC的細(xì)胞活性顯著增加(P<0.05，P<0.01)，凋亡率顯著降低(P<0.01)。見表4，圖2。

表4 抑制PDCD4蛋白表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的培養(yǎng)不同時(shí)間HUVEC增殖、凋亡的影響

圖2 抑制PDCD4蛋白表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC中PDCD4蛋白表達(dá)的影響

2.5miR-181b-5p靶向調(diào)控PDCD4蛋白的表達(dá) PDCD4 3′-UTR上存在miR-181b-5p的結(jié)合位點(diǎn)(圖3)；將miR-181b-5p mimic與PDCD4 3′-UTR-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性顯著下降(P<0.001)；與PDCD4 3′-UTR-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表5。與miR-NC組(0.45±0.05)相比，miR-181b-5p組HUVEC的PDCD4蛋白表達(dá)(0.21±0.03)顯著下調(diào)(P<0.05)，與anti-miR-NC組(0.41±0.04)相比，anti-miR-181b-5p組HUVEC的PDCD4蛋白表達(dá)(0.76±0.08)顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖4。

圖3 PDCD4的3′UTR中含有與miR-181b-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-NC組，miR-181b-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-181b-5p組圖4 miR-181b-5p調(diào)控PDCD4蛋白的表達(dá)

2.6過表達(dá)PDCD4逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-181b-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡的影響 將miR-181b-5p和PDCD4共轉(zhuǎn)染至HUVEC細(xì)胞，并用葡萄糖濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)。與高糖組相比，培養(yǎng)48 h、72 h時(shí)高糖+miR-181b-5p組HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著提高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)；與高糖+miR-181b-5p+pcDNA組相比，培養(yǎng)48 h、72 h時(shí)高糖+miR-181b-5p+pcDNA-PDCD4組HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)。提示過表達(dá)PDCD4逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-181b-5p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖和凋亡的影響。見表7。

表7 過表達(dá)PDCD4逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-181b-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的培養(yǎng)不同時(shí)間HUVEC細(xì)胞增殖及凋亡的影響

3 討 論

糖尿病患者的死亡與其并發(fā)癥和合并疾病直接相關(guān)，據(jù)統(tǒng)計(jì)〔9〕，80%的糖尿病患者死于心血管疾病。研究表明，糖尿病患者心血管疾病的發(fā)病機(jī)制與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)，血管內(nèi)皮損傷是糖尿病血管病變的重要機(jī)制〔10,11〕。因此，尋找有效的基因靶點(diǎn)保護(hù)VEC對(duì)預(yù)防糖尿病血管病變具有重要意義。

miRNA與靶基因之間的關(guān)系是復(fù)雜的，一個(gè)miRNA可以調(diào)控許多靶基因的表達(dá)，一個(gè)靶基因也可以被許多miRNA所調(diào)控，miRNA在各個(gè)領(lǐng)域的功能不斷被認(rèn)識(shí)〔12〕。研究表明，miRNA參與調(diào)節(jié)VEC的增殖、遷移和凋亡等過程，進(jìn)而影響VEC介導(dǎo)的血管生成，在心血管疾病的發(fā)生過程中起到調(diào)控作用〔13～15〕。在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能上關(guān)于miR-181b-5p的研究較多，如miR-181b-5p在卡波西肉瘤組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，miR-181b-5p可促進(jìn)卡波西肉瘤細(xì)胞增殖，抑制其凋亡〔16,17〕。在胃癌細(xì)胞中miR-181b-5p的表達(dá)呈顯著升高水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，miR-181b-5p在胃癌中可能起到癌基因的作用〔18〕。miR-181b在動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中低表達(dá)，可能通過阻斷VEC中核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)途徑和抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用〔19〕。本研究顯示，高糖誘導(dǎo)的HUVEC中miR-181b-5p表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高。上調(diào)miR-181b-5p的表達(dá)，可促進(jìn)HUVEC的增殖，降低細(xì)胞凋亡率。

PDCD4是一種細(xì)胞凋亡基因，在正常組織中廣泛表達(dá)，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡的功能，也作為一種抑癌基因，通過抑制基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯來抑制腫瘤的生長(zhǎng)〔20〕。有研究發(fā)現(xiàn)，血小板源性生長(zhǎng)因子刺激的血管平滑肌細(xì)胞中PDCD4顯著下調(diào)，過表達(dá)PDCD4可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖〔21〕。研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4是VEC中miR-155的重要靶基因，miR-155通過調(diào)節(jié)PDCD4表達(dá)參與了高糖誘導(dǎo)的VEC的凋亡過程〔22〕。本研究提示，過表達(dá)PDCD4逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-181b-5p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC增殖和凋亡的影響。

綜上，miR-181b-5p在高糖誘導(dǎo)的HUVEC中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-181b-5p可促進(jìn)HUVEC增殖，抑制其凋亡，其機(jī)制可能與miR-181b-5p靶向調(diào)控PDCD4有關(guān)，為高血糖引起的血管病變提供了新的治療靶點(diǎn)。