趙海鵬 張珍珍

(1華北電力大學(xué)醫(yī)院外科，北京 102206；2濰坊市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。研究表明85%的患者為非小細(xì)胞肺癌，而化療是治療非小細(xì)胞肺癌的主要方法，但是化療后腫瘤緩解率為40%～50%，并且化療常伴隨部分患者出現(xiàn)耐藥性及全身系統(tǒng)副作用，探索治療肺癌的新策略至關(guān)重要〔1〕。胭脂素又稱胭脂樹橙、紅木素，是一種在胭脂樹紅中發(fā)現(xiàn)的脫輔基類胡蘿卜素，既往研究表明該藥物不僅可減少炎癥反應(yīng)和氧化損傷從而預(yù)防動脈粥樣硬化，而且可通過誘導(dǎo)凋亡和阻滯細(xì)胞周期抑制腫瘤細(xì)胞的增殖〔2〕。因為胭脂素可通過抗增殖和誘導(dǎo)凋亡來抑制各種癌細(xì)胞的生長，本研究探討胭脂素和TRATL聯(lián)合用藥對非小細(xì)胞肺癌的治療作用。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，USA)購買肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460，以及BEAS-2B的人正常肺上皮細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)的所有細(xì)胞在含有10%胎牛血清(FBS，Gibco)，1%青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Gibco，Waltham，MA，USA)中進(jìn)行培養(yǎng)。用于人類肺癌治療的胭脂素(純度> 98%，美國，Sigma)溶于DMSO中，并保存在-20℃進(jìn)行后續(xù)研究，然后在DMEM培養(yǎng)基中稀釋以進(jìn)行實驗治療。

1.2細(xì)胞活力分析 為了計算胭脂素、TRAIL這兩種藥物在不同細(xì)胞系中的抑制作用，將約1×103個細(xì)胞/孔種植在96孔板中。24 h后，用不同濃度的胭脂素處理癌細(xì)胞，并在37℃下孵育24 h。最終通過噻唑藍(lán)(MTT)測定法評估細(xì)胞活力。藥物分組為：A組(0 μmol/L胭脂素)、B組(40 μmol/L脂胭素)、C組(80 μmol/L胭脂素)、D組(100 ng/ml TRAIL)、E組(200 ng/ml TRAIL)、F組(40 μmol/L 胭脂素+100 ng/ml TRAIL)。

1.3成克隆實驗 用指定濃度的胭脂素和TRAIL在生長培養(yǎng)基中處理約65%的人肺癌細(xì)胞24 h。 孵育后，將細(xì)胞收集在單獨的試管中。 從每個試管中，分別在6孔板中鋪600個細(xì)胞/孔，并使其生長2 w。14 h后，將細(xì)胞用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，使用冷卻的甲醇固定細(xì)胞15 min。然后在室溫下，將細(xì)胞在25%甲醇中的0.5%結(jié)晶紫溶液(ChemCatch，美國)染色5 min。將細(xì)胞用水洗滌3次并風(fēng)干以使用顯微鏡計數(shù)。

1.4劃痕實驗 先用馬克筆在6孔板背后均勻劃橫線，再將人肺癌細(xì)胞按1×105個細(xì)胞/孔種植于6孔板中，待細(xì)胞長滿后，使用槍頭垂直于背后的直線劃痕。然后用PBS洗滌以去除細(xì)胞碎片，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗、秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1胭脂素增強了TRAIL誘導(dǎo)的人類肺癌細(xì)胞株活力的抑制 見圖1，單獨用不同濃度的TRAIL或胭脂素處理的細(xì)胞顯示出細(xì)胞附著減少和明顯的細(xì)胞收縮，這在人正常的肺上皮細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)。但是，TRAIL和胭脂素的聯(lián)合治療增強了這種對細(xì)胞生長的抑制作用。用TRAIL和胭脂素處理的肺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力要比單一處理的細(xì)胞低。正常細(xì)胞BEAS-2B在用胭脂素和(或)TRAIL處理后，各組之間無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 不同藥物組對各細(xì)胞株活力的影響值)

圖1 肺癌細(xì)胞活力檢測(MTT，×40)

2.2胭脂素和TRAIL聯(lián)合抑制人肺癌細(xì)胞系中的集落形成和遷移 如圖2所示單獨用胭脂素或TRAIL處理的肺癌細(xì)胞株的集落形成水平以劑量依賴的方式明顯減弱。值得注意的是，與單一藥物治療相比，聯(lián)合治療促進(jìn)了肺癌細(xì)胞克隆能力的降低(表2)。劃痕實驗表明，單獨使用TRAIL或胭脂素的治療可適度降低遷移的肺癌細(xì)胞的比例。但是聯(lián)合處理增強了這種效應(yīng)(圖3，表3)。

圖2 肺癌細(xì)胞集落形成能力檢測(結(jié)晶紫染色，×40)

表2 藥物組對各細(xì)胞株集落形成的影響

圖3 肺癌細(xì)胞遷移能力檢測(×40)

表3 各細(xì)胞株遷移能力的影響

3 討 論

據(jù)報道，在全世界人類中，肺癌在所有腫瘤中的發(fā)病率最高〔3〕。本研究探討胭脂素對人肺癌進(jìn)展的影響。胭脂素可用于多種疾病，如肺部損傷、血液系統(tǒng)腫瘤和腦損傷的治療〔4,5〕。然而，到目前為止，人們關(guān)于胭脂素對肺癌的影響知之甚少，尤其是與TRAIL聯(lián)合使用時。TRAIL是屬于TNF家族的成員，可以被DR4和DR5結(jié)合，激活細(xì)胞凋亡蛋白酶(Caspase)-8裂解。 Caspase-8活性對于Caspase-9表達(dá)很重要，隨后刺激Caspase-3裂解并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔6〕。在此過程中，抗凋亡分子B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)被下調(diào)，促凋亡成員Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)被上調(diào)。此外，TRAIL作為腫瘤抑制因子，已被用作通過凋亡誘導(dǎo)治療各種癌癥的有效藥物〔7〕。胭脂素是一種天然的類胡蘿卜素，從Bixa Orellana的種子中分離出來〔8〕。類胡蘿卜素聯(lián)蛋白(BX)可減少炎癥反應(yīng)和氧化損傷。研究表明，食用胭脂素可通過減少氧化損傷，炎癥反應(yīng)和血脂異常來預(yù)防動脈粥樣硬化〔9〕。胭脂素在癌癥的進(jìn)展和發(fā)展中發(fā)揮抗增殖和凋亡的作用〔10〕。本研究結(jié)果表明胭脂素和TRAIL治療肺癌，特別是兩種藥物的結(jié)合，顯著下調(diào)了癌細(xì)胞的增殖和遷移，這與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。