曹光軍 武金程 王鵬飛

(鶴壁市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鶴壁 458030)

老年癡呆是一種起病隱匿的進(jìn)行性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變〔1〕。臨床上的主要特征是記憶力障礙、執(zhí)行功能障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)及人格和行為的改變等。并且隨著年齡的不斷增加，其發(fā)病率也逐漸升高，嚴(yán)重影響患者的生活，給家庭也帶來(lái)了極大的負(fù)擔(dān)〔2〕。miRNA是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的非編碼單鏈小分子RNA，穩(wěn)定存在于外周血中，主要誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)，并參與腫瘤的形成、胚胎發(fā)育和免疫等諸多過(guò)程。以往血清miR-181a的研究方向主要是癌癥及心血管疾病發(fā)展等方面，但有相關(guān)報(bào)告表示miR-181a能夠影響大腦海馬神經(jīng)元突觸生長(zhǎng)，通過(guò)調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/糖原合成酶激酶(GSK)3β信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響〔3,4〕，但目前尚未見(jiàn)miR-181a在癡呆患者血清中的表達(dá)及臨床意義的具體研究結(jié)果。因此為了更好地了解血清miR-181a水平對(duì)老年癡呆癥患者的意義，本研究主要探討血清miR-181a水平與老年癡呆患者臨床癥狀的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2018年12月在鶴壁市人民醫(yī)院收治的74例老年癡呆患者作為研究對(duì)象，男44例，女30例；年齡60～72歲，平均(70.35±7.89)歲。其中阿爾茨海默病(AD)組35例，男22例，女13例，平均(72.65±6.75)歲；輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)組39例，男22例，女17例，平均(74.58±7.25)歲。并選擇同期的健康老人45例作為對(duì)照組，男25例，女20例，平均(75.42±7.89)歲。三組對(duì)象的年齡、性別無(wú)明顯差異(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①AD組患者均符合美國(guó)國(guó)家衰老研究所(NIA)與AD學(xué)會(huì)(AA)AD 診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，MCI組患者符合Petersen〔6〕修訂的MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)；②AD患者的精神癥狀評(píng)分在14～23分，MCI患者的精神癥狀評(píng)分≥24分；③年齡≥60歲；④患者及家屬知曉本研究?jī)?nèi)容，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝腎功能不全；②患者病例資料不完整；③具有意識(shí)障礙，聽(tīng)覺(jué)障礙；④既往有精神病史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1樣本收集 獲得患者及家屬的同意后，使用無(wú)抗凝劑的采血管在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周靜脈血5 ml，并以2 500 r/min離心10 min，再使用PE管提取清液，存放至-80℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2血清miRNA提取 從-80℃冰箱將所有樣品取出后向血清樣本中加入比例為1∶5的QIAzol溶解試劑進(jìn)行統(tǒng)一溶解，在室溫下靜放10 min，再參照miRNA試劑盒上面的步驟提取血清總miRNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，置于-80℃冰箱保存。

1.2.3熒光定量聚合酶檢測(cè)血清miR-181a 采用美國(guó)Bio-Red公司的逆轉(zhuǎn)錄-試劑盒對(duì)SYBR Green real-time PCR進(jìn)行操作，并使用廣州銳博生物有限公司合成的miR-181a或U6特異性上、下游引物，反應(yīng)體系為15 μl。其PCR儀器設(shè)置參數(shù)為95℃、2 min、40個(gè)循環(huán)，93℃、15 s、30個(gè)循環(huán)，70℃、1 min、30個(gè)循環(huán)。并利用CFX manager 3.0軟件對(duì)Cq值進(jìn)行分析，再通過(guò)2-△Ct法(△Ct=CTmiRNA-CTU6)計(jì)算miR-181a的相對(duì)表達(dá)量。

1.3觀察標(biāo)準(zhǔn)與測(cè)定方法 對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行全面檢測(cè)，根據(jù)身高、體重進(jìn)行體重指數(shù)(BMI)的計(jì)算，但在檢測(cè)前是除去研究對(duì)象的衣服、鞋、帽子等所有影響計(jì)算結(jié)果的因素。一般采用簡(jiǎn)單智力狀態(tài)檢查表(MMSE)，主要是從定向力、記憶力、注意力與計(jì)算力、回憶力及語(yǔ)言表達(dá)力等幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)定，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別為10分、3分、5分、3分、9分，總分為30分，分?jǐn)?shù)越高，表示認(rèn)知患者認(rèn)知功能越好，一般大于27表示認(rèn)知功能正常，檢測(cè)者均在安靜環(huán)境下進(jìn)行〔7〕。對(duì)于血清中同型半胱氨酸(Hcy)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、脂聯(lián)素(ANP)水平表達(dá)量的檢測(cè)，其中Hcy、TC、TG、ANP水平表達(dá)量的酶測(cè)定是采用北京強(qiáng)生生物科技有限公司的試劑盒進(jìn)行操作；LDL-C、HDL-C是采用直接測(cè)定法嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS19.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1三組臨床資料比較 三組教育程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。三組LDL-C、Hcy、ANP、MMSE兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組基本資料比較

2.2三組miR-181a表達(dá)水平的比較 AD組血清中miR-181a的表達(dá)水平(1.25±0.35)高于MCI組(0.75±0.45)、對(duì)照組(0.56±0.75)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.3血清miR-181a表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 進(jìn)一步分析老年癡呆患者中血清miR-181a水平與其他臨床血清指標(biāo)的關(guān)系，其中血清miR-181a水平與血清Hcy水平呈正相關(guān)(r=0.568，P=0.004)，血清miR-181a水平與血清ANP水平、MMSE評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.562，P=0.001；r=-0.624，P=0.003)。

2.4老年癡呆患者采用Logistic回歸分析比較 以老年癡呆患者有無(wú)癡呆為因變量(否=0、是=1)，采用Logistic回歸分析，結(jié)果顯示教育程度(高中以上)為老年癡呆患者的保護(hù)因素，血清miR-181a≥0.78、Hcy≥19.25 mmol/L為老年癡呆患者的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表2。

表2 老年癡呆患者采用Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

老年癡呆最為常見(jiàn)的是AD，是一種不可逆的慢性進(jìn)展性疾病，病情隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)，具體因素并不明確〔8〕。但目前主要與神經(jīng)遞質(zhì)、遺傳因素、免疫因素及環(huán)境因素等相關(guān)，主要特征性病理的改變是β淀粉樣蛋白沉積形成的細(xì)胞外老年斑和tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)原丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生等〔9〕。隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展患者逐漸出現(xiàn)了記憶力障礙、認(rèn)知障礙、精神障礙及行為的異常，嚴(yán)重影響患者的社交、職業(yè)與生活功能〔10〕。目前對(duì)于老年癡呆患者的檢查主要是影像學(xué)、腦電圖、基因檢測(cè)及腦脊液檢測(cè)，但這些檢測(cè)并不完善，不能在早期快速準(zhǔn)確安全的診斷該疾病，存在一定的缺陷〔11，12〕。因此有相關(guān)的學(xué)者提出老年癡呆的發(fā)生與外周血的相關(guān)指標(biāo)水平有一定的關(guān)系。

人類成熟miR-181家族存在4種，分別是miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d，既往研究發(fā)現(xiàn)miR-181家族更多是與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔13，14〕，但張仕娟等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死后認(rèn)知功能受損患者血清miR-181c水平升高，血清miR-181c水平升高是急性腦梗死后認(rèn)知功能受損的獨(dú)立危險(xiǎn)因素和預(yù)測(cè)指標(biāo)。miR-181a的表達(dá)含量在神經(jīng)組織中比較豐富，并與疾病的發(fā)生發(fā)展有著重要關(guān)系。有相關(guān)研究表明，miR-181a表達(dá)量過(guò)多會(huì)影響神經(jīng)突觸的分支數(shù)量及樹(shù)突的發(fā)育狀況，導(dǎo)致腦部疾病如AD的基因表達(dá)水平上升。miR-181a表達(dá)在AD的突觸可塑性中起著重要作用，當(dāng)其表達(dá)量過(guò)高時(shí)，可對(duì)哺乳動(dòng)物的認(rèn)知功能造成一定的障礙，并參與調(diào)控學(xué)習(xí)和記憶力等認(rèn)知功能、神經(jīng)再生及AD等神經(jīng)疾病〔16，17〕。本研究結(jié)果表示患者的認(rèn)知功能與血清中miR-181a表達(dá)水平上升有關(guān)；血清miR-181a和Hcy水平表達(dá)量上升，血清ANP水平和精神癥狀下降，可以反映患者的認(rèn)知功能的嚴(yán)重程度。采用Logistic回歸分析探討血清miR-181a水平與老年癡呆的關(guān)系，結(jié)果表明血清miR-181a可反映患者癡呆的程度。

Hcy是一種人體內(nèi)的含硫氨基酸，為蛋氨酸和半胱氨酸代謝過(guò)程的重要中間產(chǎn)物，但本身不參與蛋白質(zhì)的合成〔18〕。有相關(guān)研究顯示Hcy水平表達(dá)量過(guò)高，會(huì)降低人體的甲基化和抗氧化能力，容易導(dǎo)致老年癡呆的發(fā)生〔19，20〕。本研究結(jié)果顯示血清Hcy與老年癡呆癥的發(fā)生相關(guān)。ANP是由心房肌細(xì)胞合成并釋放的肽類激素，主要是調(diào)節(jié)中樞炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮等作用，并有研究顯示血清ANP水平量過(guò)高時(shí)MCI患者的病情發(fā)展較慢〔21，22〕。本研究表明血清ANP水平表達(dá)量與AD相關(guān)。

綜上所述，檢測(cè)血清miR-181a的水平表達(dá)量能夠判斷老年癡呆患者臨床癥狀的嚴(yán)重程度，為患者的診斷及治療提供了一定的參考。但是由于研究的樣本量不足，因此更多研究結(jié)果，需進(jìn)一步開(kāi)展。