宋曉兵， 彭埃天， 凌金鋒， 崔一平， 程保平， 陳 霞

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640

柑橘黃龍病Citrus Huanglongbing是一種毀滅性病害，能侵染各種柑橘類植物，對(duì)我國柑橘產(chǎn)業(yè)造成極大的威脅。柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama不僅是柑橘上的一種重要害蟲，也是柑橘黃龍病的重要傳播蟲媒(杜丹超等，2011； Cenetal.,2012)。目前對(duì)柑橘黃龍病尚缺乏有效的防治藥劑和抗病品種(宋曉兵等，2016)。加強(qiáng)對(duì)柑橘木虱的防治，對(duì)控制柑橘黃龍病的流行，降低害蟲本身對(duì)柑橘的危害都具有重要意義(宋曉兵等，2018)。

細(xì)菌和昆蟲之間除了少數(shù)屬于病原菌與寄主的關(guān)系外，存在著廣泛的非致病性關(guān)系，某些細(xì)菌則是寄主生長繁殖所必需的(Brummeletal.,2004; Dillon & Charnley,2002)。如昆蟲腸道內(nèi)生細(xì)菌在食物消化、營養(yǎng)吸收、繁殖及信息素的合成中發(fā)揮重要作用(Campbell,1990； Dillon & Charnley,2002； Tokudaetal.,2009)。內(nèi)生細(xì)菌不僅能夠?yàn)榧闹鞯纳L發(fā)育提供營養(yǎng)，還能合成多種生物活性物質(zhì)、調(diào)節(jié)寄主的免疫、抵御病原生物的入侵和定殖等(魏舸等，2018)。柑橘木虱主要以吸食植物韌皮部汁液為主，其本身沒有合成膽固醇、必需氨基酸和維生素的能力，而柑橘木虱體內(nèi)普遍存在著內(nèi)生細(xì)菌，為其提供生長發(fā)育所需的脂類化合物、維生素和必需氨基酸，內(nèi)生細(xì)菌與木虱長期共存、互惠互利、協(xié)同進(jìn)化(徐紅星等，2009)。目前，國外已提出一種創(chuàng)新性的病蟲害管理策略——共生控制(paratransgenic control)，即利用寄主的共生細(xì)菌控制昆蟲媒介或病原體(Bextineetal.,2004； Koloraetal.,2015)。如基于胞質(zhì)不相容性(cytoplasmic incompatibility，CI)的原理，將攜帶Wolbachia的雄蚊與不攜帶或者攜帶不同Wolbachia體型的雌蚊交配，雌蚊產(chǎn)的卵將不會(huì)孵化(潘曉玲等，2014； 周麗麗等，2010； Dutraetal.,2016)。

本研究通過分離培養(yǎng)及鑒定不同地區(qū)柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌，一方面明確柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生菌的區(qū)域多樣性，為研究內(nèi)生細(xì)菌與柑橘木虱之間的互作提供基礎(chǔ)；另一方面探討內(nèi)生細(xì)菌在柑橘木虱生命活動(dòng)中所起的作用，對(duì)利用潛在的候選細(xì)菌通過共生控制防治柑橘木虱或黃龍病具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試柑橘木虱

柑橘木虱成蟲分別采集自廣東省廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)(默科特)、廣州市天河區(qū)五山大豐街(九里香)、惠州市龍門縣永漢鎮(zhèn)(沙糖橘)、肇慶市德慶縣九市鎮(zhèn)(貢柑)、肇慶市高要區(qū)新橋鎮(zhèn)(貢柑)、陽江市陽西縣儒洞鎮(zhèn)(馬水橘)、河源市紫金縣藍(lán)塘鎮(zhèn)(春甜橘)和廣西桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)(蜜橘)共8個(gè)地區(qū)，每個(gè)地區(qū)采集成蟲20頭，重復(fù)采集2次。采集的柑橘木虱成蟲(雌雄隨機(jī))連同其寄主嫩梢枝葉置于塑料瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，室溫保存1～2 d內(nèi)進(jìn)行分離。

1.2 試劑和引物

2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans2K DNA Marker購自全式金生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。PCR引物對(duì)27F/1492R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 培養(yǎng)基

YEB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸出粉5 g、蔗糖5 g、氯化鈉5 g、七水硫酸鎂1 mmol·L-1、蒸餾水定容至1000 mL、pH為7.0。

YEB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸出粉5 g、蔗糖5 g、氯化鈉5 g、七水硫酸鎂1 mmol·L-1、瓊脂粉15 g、蒸餾水定容至1000 mL、pH為7.0。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌的分離

田間采集的柑橘木虱成蟲置于無菌離心管中帶回實(shí)驗(yàn)室，將木虱置于-20℃冰箱中冷凍3～5 min，降低木虱的活動(dòng)能力，然后分裝于1.5 mL離心管內(nèi)，每管5頭，重復(fù)4次。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行分離操作，將木虱置于70%乙醇中浸泡30 s，隨后用無菌水漂洗3～4次，最后一次漂洗液涂平板驗(yàn)證滅菌效果。將柑橘木虱于無菌濾紙上晾干后置于滅菌離心管中，加入500 μL YEB液體培養(yǎng)基，然后用一次性組織研磨杵將蟲體完全搗碎，分別吸取100 μL混合液涂布到Y(jié)EB平板培養(yǎng)基上，每管涂布5個(gè)平板，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落形態(tài)。根據(jù)菌落形態(tài)(大小、形狀、顏色、表面光澤、透明度和質(zhì)地等)分別挑取培養(yǎng)基表面不同種類的細(xì)菌菌落，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板上純化，純化內(nèi)生細(xì)菌接種于YEB培養(yǎng)基斜面上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 內(nèi)生細(xì)菌分子鑒定

1.5.1 DNA提取 將平板上長出的所有不同形態(tài)細(xì)菌挑出，并將其進(jìn)一步純化，得到單菌落。然后將接種單菌落至YEB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)24 h，28 ℃，120 r·min-1。取適量菌液于1.5 mL離心管中，10000 r·min-1離心30 s，棄去上清液，采用DNA提取試劑盒提取菌株的總DNA。

1.5.2 16S rDNA基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)Lane (1991)的方法，采用引物對(duì)27F/1492R (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA基因V1～V9區(qū)。PCR反應(yīng)體系：模板1.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測后剩余的PCR產(chǎn)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 16S rDNA基因測序及比對(duì) 于瓊脂糖凝膠上割取PCR產(chǎn)物的目的條帶，利用Axygen膠回收試劑盒回收純化，然后送至Invitrogen公司利用引物27F/1492R進(jìn)行兩端測序。利用DNAStar軟件(DNASTAR Inc， Madison，USA)對(duì)所獲得的目的基因序列進(jìn)行拼接，然后利用BLAST程序進(jìn)行序列相似性比對(duì)，從而鑒定所分離的柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的種屬。

1.5.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 選取所有地區(qū)的優(yōu)勢菌株序列，利用軟件MEGA 6.0進(jìn)行聚類分析，采用鄰近相接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。對(duì)分離優(yōu)勢菌株數(shù)量居多的幾個(gè)地區(qū)采用Venny 2.1在線軟件(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)制作韋恩圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的分離

對(duì)采集自廣東、廣西8個(gè)地區(qū)的柑橘木虱進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng)，共分離保存形態(tài)特征各異的柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌114株，其中,廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)(BY)17株，廣州市天河區(qū)五山大豐街(TH)12株，廣東省德慶縣九市鎮(zhèn)(DQ)11株，廣東省高要市新橋鎮(zhèn)(GY)20株，廣西省桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)(GX)10株，廣東省龍門縣永漢鎮(zhèn)(LM)17株，廣東省陽西縣儒洞鎮(zhèn)(YX)12株，廣東省紫金縣藍(lán)塘鎮(zhèn)(ZJ)15株。部分內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)如圖1。根據(jù)菌落形態(tài)(大小、形狀、顏色、表面光澤、透明度和質(zhì)地等)分別挑取培養(yǎng)基表面不同種類的細(xì)菌菌落，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板上劃線純化，接種于YEB培養(yǎng)基斜面上，4 ℃保存。

圖1 柑橘木虱部分內(nèi)生細(xì)菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphologies of several endophytic bacterial isolates from D. citri

2.2 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增

分別提取柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的總DNA，采用引物對(duì)27F/1492R擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA基因V1-V9區(qū)，產(chǎn)物長度1500 bp左右。電泳結(jié)果顯示，分離獲得的柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌均擴(kuò)增到明亮條帶，與預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度相同(圖2、圖3)。

圖2 柑橘木虱(白云)內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增分析Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA genes of endophytic bacteria in D. citri from BaiyunM:Trans2K DNA Marker；1～17:模板為17個(gè)內(nèi)生細(xì)菌的基因組DNA。M: Trans2K DNA Marker; 1-17: The templates were genomic DNA samples of 17 endophytic bacterial isolates.

圖3 柑橘木虱(天河)內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增分析Fig.3 PCR amplification of 16S rDNA genes of endophytic bacteria in D. citri from TianheM:Trans2K DNA Marker；1～12:模板為12個(gè)內(nèi)生細(xì)菌的基因組DNA。M: Trans2K DNA Marker; 1-12: The templates were genomic DNA samples of 12 endophytic bacterial isolates.

2.3 柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

對(duì)獲得的目的基因序列進(jìn)行拼接，獲得114個(gè)細(xì)菌16S rDNA序列，利用BLAST程序進(jìn)行序列相似性比對(duì)，將所分離的內(nèi)生細(xì)菌歸為細(xì)菌界的3個(gè)門的15個(gè)屬，分別為厚壁菌門Firmicutes桿菌綱Bacilli芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄球菌屬Staphylococcus、乳球菌屬Lactococcus、芽孢八疊球菌屬Sporosarcina和喜氨菌屬Ammoniphilus；變形菌門Proteobacteria γ-變形菌綱Gammaproteobacteria的假單胞菌屬Pseudomonas、泛菌屬Pantoea、腸桿菌屬Enterobacter，α-變形菌綱Alphaproteobacteria的副球菌屬Paracoccus、短波單胞菌屬Brevundimonas和赤桿菌屬Erythrobacter，β-變形菌綱Betaproteobacteria的代爾夫特菌屬Delftia；放線菌門Actinobacteria微球菌綱Micrococcales的微球菌屬M(fèi)icrococcus、考克氏菌屬Kocuria和短小桿菌屬Curtobacterium。選取有代表性的特異性菌株序列15個(gè)上傳到GenBank中(表1)。

在114個(gè)柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌中，芽孢桿菌屬59株為優(yōu)勢菌群，占分離細(xì)菌總數(shù)的51.75%；假單胞菌屬14株，占12.28%；泛菌屬10株，占8.77%；其他細(xì)菌占27.19%，在各個(gè)地區(qū)的柑橘木虱中不穩(wěn)定存在、僅在某些地區(qū)存在的細(xì)菌可能來源于自然環(huán)境或植物寄主，并未與柑橘木虱之間形成真正的共生關(guān)系，屬于過路菌群。不同地區(qū)柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量存在明顯差異，其中白云采集的木虱獲得的細(xì)菌種類最多，歸為8個(gè)屬17株；陽西采集的木虱獲得的細(xì)菌種類最少，歸為2個(gè)屬12株(表2)。

表1 15株代表性柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的鑒定情況Table 1 Identification of 15 representative endophytic bacteria of D. citri

表2 柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的鑒定分類Table 2 Identification of endophytic bacterial isolates from D. citri

2.4 優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌聚類分析

選取所有地區(qū)的芽孢桿菌屬菌株序列，采用軟件MEGA 6.0進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。聚類結(jié)果表明，柑橘木虱芽孢桿菌屬59個(gè)菌株,主要為巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium21株、短小芽孢桿菌B.pumilus19株、蠟狀芽孢桿菌B.cereus14株和吉氏芽孢桿菌B.gibsonii5株(圖4)。7個(gè)地區(qū)芽孢桿菌的聚類結(jié)果顯示，4個(gè)種類的芽孢桿菌在7個(gè)地區(qū)的分布存在差異，巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌在多數(shù)地區(qū)(均為6個(gè))均有分布，吉氏芽孢桿菌僅在廣西、德慶、白云3個(gè)地區(qū)分布(圖4)。對(duì)芽孢桿菌屬細(xì)菌分離數(shù)量居多的高要、龍門、陽西和廣西4個(gè)地區(qū)，利用Venny 2.1在線軟件制作韋恩圖。結(jié)果顯示，巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌是4個(gè)地區(qū)共有的芽孢桿菌屬細(xì)菌(圖5)，說明這2種細(xì)菌在柑橘木虱體內(nèi)有更廣泛的適用性。

3 討論與結(jié)論

柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌菌群是一個(gè)復(fù)雜敏感的生物系統(tǒng)，不同的地理區(qū)域條件下的內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)不盡相同。本研究中源自8個(gè)地區(qū)的柑橘木虱可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌114株。以柑橘為寄主的7個(gè)地區(qū)采集的木虱上均分離到芽孢桿菌，而天河九里香上采集的柑橘木虱未分離到芽孢桿菌，這可能與寄主差異有關(guān)，推測柑橘木虱的內(nèi)生細(xì)菌有一部分來源于寄主植物，可能是柑橘木虱取食寄主汁液，將細(xì)菌從寄主植物轉(zhuǎn)移到體內(nèi)，其種群結(jié)構(gòu)會(huì)隨著寄主植物的改變而變化。聚類進(jìn)化分析表明，優(yōu)勢菌群芽孢桿菌屬主要?dú)w為4個(gè)種類,本研究未分離到對(duì)昆蟲具有致死效果的蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis。巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌均能產(chǎn)生細(xì)菌素(王偉等，2019)，芽孢桿菌細(xì)菌素具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可用于多種作物病蟲害的生物防治(李依韋等，2019； 楊得強(qiáng)等，2020; 張玉棟，2016)。本研究篩選到的芽孢桿菌是否對(duì)植物病原菌有抑制效果有待下一步研究。

楊金霞(2013)利用TSB培養(yǎng)基添加柞蠶蛹血淋巴分離柑橘木虱培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，獲得8種內(nèi)生細(xì)菌：木糖葡萄球菌Staphylococcusxylosus、葡萄球菌屬Staphylococcussp.、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、腸桿菌屬Enterobactersp.、短小桿菌屬的Curtobacteriumoceanosedimentum、磚紅色微桿菌Microbacteriumtestacyeum、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia、檸檬色短小桿菌Curtobacteriumcifreum，與本研究結(jié)果較一致，除嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌外的7種內(nèi)生細(xì)菌都能歸到本研究所分離的15個(gè)細(xì)菌屬中。孫麗琴(2014)對(duì)不攜帶黃龍病菌的柑橘木虱進(jìn)行分離鑒定，共獲得14株菌株，分屬于芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬Erwinia、克雷伯氏桿菌屬Klebsiella、葡萄球菌屬、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、泛菌屬、果膠桿菌屬Pectobacterium、沙門氏菌屬Salmonella、鏈霉菌屬Streptomyces、Massiliabrevitalea等10個(gè)細(xì)菌屬，與本研究所分離的15個(gè)屬存在較大差異，可能是由于地域、寄主差異及分離培養(yǎng)條件不同所致。

圖4 柑橘木虱優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌多樣性聚類Fig.4 Cluster analysis of dominant endophytic bacterial species of D. citri

圖5 基于4個(gè)地區(qū)芽孢桿菌屬細(xì)菌的韋恩圖Fig.5 Venn diagram of Bacillus bacteria in 4 regions

王愛華等(2010)采用常規(guī)方法分離培養(yǎng)柑橘內(nèi)生細(xì)菌，共獲得21株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，分別歸為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬Pseudomonas和葡萄球菌屬等，其中芽孢桿菌屬細(xì)菌為優(yōu)勢菌屬，共有11株，與本研究分離到的優(yōu)勢菌屬相一致。殷幼平等(2011)從柑橘木虱中發(fā)現(xiàn)了大量的條件致病菌成團(tuán)泛菌Pantoeaagglomerans，已有研究報(bào)道成團(tuán)泛生菌屬和木糖氧化產(chǎn)堿菌屬Alcaligenesxylosoxidans細(xì)菌被認(rèn)為是共生控制的候選細(xì)菌(Blakeetal.,2004； Riehleetal.,2007)，成團(tuán)泛菌與柑橘木虱的相互作用值得深入研究。Koloraetal. (2015)采用標(biāo)準(zhǔn)分離方法培養(yǎng)柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌，分離出短小芽孢桿菌屬Lysinibacillus、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、蠟狀芽孢桿菌屬Bacilluscereus、腐生葡萄球菌屬Staphylococcussaprophyticus、鏈霉菌屬、腸桿菌屬、成團(tuán)泛生菌屬、惡臭假單胞菌屬Pseudomonasputida、木糖氧化產(chǎn)堿菌屬和無色桿菌屬Chryseomonasluteola，與本研究所分離的內(nèi)生細(xì)菌的種類大致相同。綜上，芽孢桿菌目的細(xì)菌廣泛分布在各地柑橘木虱體內(nèi)，值得作為潛在的候選細(xì)菌進(jìn)行共生控制柑橘木虱的研究。

內(nèi)生細(xì)菌與宿主的免疫系統(tǒng)、外來病原、環(huán)境變化、營養(yǎng)攝入，甚至內(nèi)生細(xì)菌種群之間都相互影響與相互適應(yīng)，形成復(fù)雜的互作關(guān)系(魏舸等，2018)。在昆蟲內(nèi)生細(xì)菌的功能研究中，分析微生物的生物群落及多樣性必不可少，分離、培養(yǎng)、鑒定是研究昆蟲內(nèi)生細(xì)菌的經(jīng)典方法。然而，昆蟲體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境難以在體外模擬，多數(shù)昆蟲共生細(xì)菌都無法在體外進(jìn)行培養(yǎng)。因此，長期以來有關(guān)昆蟲共生細(xì)菌的多樣性及互作研究進(jìn)展緩慢。本研究僅采用了YEB培養(yǎng)基進(jìn)行柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng)，對(duì)于一些難培養(yǎng)細(xì)菌可能存在沒有分離出來的情況，如柑橘木虱內(nèi)共生菌Wolbachia、Carsonella、Oscillospira、Arsenophonus、Profftella等(李翌菡，2016； 殷幼平等，2011； Blakeetal.,2004; Songetal.,2019； Subandiyahetal.,2000)，下一步需要通過高通量測序技術(shù)對(duì)柑橘木虱體內(nèi)細(xì)菌組成及菌群多樣性進(jìn)行分析，以進(jìn)行柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌的多樣性以及功能研究。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造昆蟲內(nèi)生細(xì)菌，用于共生控制人類病害、害蟲及植物病害蟲媒等具有廣闊的應(yīng)用前景。如：通過改造獵蝽共生菌Rhodococcusrhodnii表達(dá)cecropin A，對(duì)引起美洲錐蟲病的克氏錐蟲TrypanosomacruziChagas有良好的抑制效果(Beardetal.,1992)；通過改造按蚊共生細(xì)菌Serratia AS1分泌表達(dá)多種抗瘧活性蛋白，從而在按蚊體內(nèi)能高效特異殺滅惡性瘧原蟲(Wangetal.,2017)；通過改造葉蟬共生菌Alcaligenessp.有效控制葡萄皮爾斯病的傳播(Bextineetal.,2004)。本研究對(duì)于今后利用柑橘木虱內(nèi)生細(xì)菌自身的特性，抑或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造內(nèi)生細(xì)菌，在控制柑橘黃龍病和阻斷蟲媒的傳播上具有重要借鑒意義。