張秀妍 葛祥武 王 駿 大連市檢驗檢測認證技術(shù)服務(wù)中心（遼寧，大連，116023）王慧龍 大連理工大學(xué)（遼寧，大連，116023）

金剛烷胺是金剛烷的衍生物， 屬于三環(huán)胺類，是人用抗病毒藥物，許多國家在家禽畜牧業(yè)生產(chǎn)中已明確禁止使用金剛烷胺，但仍然存在非法使用的情況［1］，我國農(nóng)業(yè)部公告第560 號《獸藥地方標準廢止目錄》規(guī)定，金剛烷胺不得檢出。

目前，對金剛烷胺的檢測較多，但多集中于雞肉、雞蛋等畜產(chǎn)品，對牛奶中金剛烷胺檢測的研究較少，本論文對牛奶中金剛烷胺的檢測方法進行建立、優(yōu)化。

1 實驗方法

1.1 樣品采集及準備

實驗中用到的牛奶為生鮮乳， 采自養(yǎng)殖場，冷凍備用。

1.2 儀器設(shè)備

I-Class 高效液相色譜（美國Waters 公司）；TQS 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters 公司，配有電噴霧ESI 源）；超純水儀（美國Millipore 公司）；冷凍離心機（日本HITACHI 公司）；氮吹儀；渦旋振蕩器；固相萃取裝置；電子天平等。

1.3 藥品與試劑

金剛烷胺溶液標準物質(zhì)（1 000μg/mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）、金剛烷胺-D15 溶液標準物質(zhì)（10μg/mL，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心）。

Bond Elut C18 小柱 （Agilent，100mg/3mL）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；冰乙酸（優(yōu)級純，天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）；磷酸二氫鉀（優(yōu)級純，天津科密歐公司）；甲酸（優(yōu)級純，Thermo 試劑）等。

0.1%的甲酸乙腈溶液：取1mL 甲酸用乙腈定容至1L；

0.1%的甲酸水溶液：取1mL 甲酸用超純水稀釋至1L；

1.8%的三氯乙酸乙腈水溶液：稱取20g 三氯乙酸溶于10%的乙腈水溶液中；

磷酸鹽緩沖溶液0.1mol/L：稱取13.6g 磷酸二氫鉀，用水定容至1L，用10.0mol/L 的氫氧化鈉調(diào)PH至6.9-7.1 。

1%的冰乙酸乙腈溶液：取10mL 冰乙酸用乙腈稀釋至1L。

1.4 配制標準溶液

移取金剛烷胺溶液0.1mL 用乙腈定容至100mL， 配成濃度為1.0μg/mL 的混合外標中間溶液，用乙腈稀釋成100ng/mL 外標混合使用溶液。 移取金剛烷胺-D15 溶液1mL，用乙腈定容至100mL，配成100ng/mL 內(nèi)標使用溶液。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取

準確稱取牛奶2.0g，置于50mL 塑料離心管中，加入0.1mL 內(nèi)標使用溶液， 震蕩混勻； 加入10mL 1%的冰乙酸乙腈溶液， 以2 000rpm 的速度渦旋振蕩1min，4℃，9 000rpm 離心10 分鐘，上清液移入另一離心管中。 再加入10mL 1%的冰乙酸乙腈溶液，重復(fù)提取一次， 離心后合并上清液，45℃氮氣吹干，加入2.5mL 磷酸鹽緩沖液，渦旋振蕩，待凈化。

1.5.2 凈化

C18 小柱依次經(jīng)2.5mL 乙腈、2.5mL 磷酸鹽緩沖液活化后， 將1.5.1 的提取液過柱， 待自然流干后，用2.5mL 超純水洗柱，加壓擠干。用1mL 0.1%的甲酸乙腈水溶液（3∶7）洗脫，收集洗脫液，過0.2μm有機系濾膜后上機測定。

1.6 儀器條件

色譜條件：Waters BEH C18 反相色譜柱（2.1mm×100mm，粒度1.7μm）；柱溫為35℃；進樣量為2μL； 流動相為0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液（8：92，V/V）；流速為0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式；去溶劑氣溫度：500℃；霧化氣、干燥氣為高純氮氣，氣體流量為800L/Hr；碰撞氣為氬氣，輸出壓力為0.07MPa；離子模式：多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式；選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子（Parent ion）、子離子（Product ion）、碰撞能量（CE）和錐孔電壓（CV）質(zhì)譜參數(shù)。 （見表1）。

表1 金剛烷胺和氟喹諾酮類藥物質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 提取試劑的確定

測定牛奶的基質(zhì)干擾物主要為脂肪和蛋白質(zhì)，為了提高檢測靈敏度，降低基質(zhì)干擾，需要將樣品進行適當(dāng)?shù)膬艋蜐饪s。 因金剛烷胺在乙腈中的溶解性較好，且乙腈有沉淀蛋白的作用，同時對樣品中脂肪的提取率比較低， 故選擇乙腈為提取溶劑。在商檢標準SN/T4253-2015 中［2］，用三氯乙酸乙腈水溶液提取金剛烷胺等抗病毒類藥物，本論文綜合考察乙腈、1%的甲酸乙腈溶液、1.8%的三氯乙酸乙腈水溶液、2%的冰乙酸乙腈溶液的提取效果， 三氟乙酸的乙腈水溶液和1%的甲酸乙腈溶液， 提取效果均較好，但考慮到三氟乙酸處理不徹底會造成質(zhì)譜的損害［3］，本論文選用1%的甲酸乙腈溶液為牛奶中金剛烷胺的提取溶液。

2.2 固相萃取小柱的確定

在研究牛奶中金剛烷胺的檢測方法時，仲伶俐等人采用HLB 小柱，對磷脂和蛋白具有很好去除作用。 趙靜等人在對牛奶和奶粉中維吉尼霉素殘留量的測定中，采用C18 小柱對牛奶進行凈化［4］，商檢標準SN/T4253-2015 中，用混合陽離子交換固相萃取小柱凈化， 在比較了這三種小柱的凈化洗脫效果后，本論文選用具有高鍵合度、低流失、高回收率、選擇性廣、對金剛烷胺凈化洗脫效果好、回收率較高的C18 小柱。

2.3 工作曲線的繪制

稱取5 份牛奶空白樣品，每份2g，分別置于50mL離心管中，加入金剛烷胺標準使用溶液，處理后上機的濃度梯度依次為0.5、1.0、2.0、5.0 和10.0 ng·mL-1，其中同位素內(nèi)標的含量為10.0 ng·mL-1。 金剛烷胺以金剛烷胺-D15 為內(nèi)標物進行定量計算。 按照1.5 進行樣品前處理、1.6 儀器條件上機檢測，數(shù)據(jù)處理選用內(nèi)標法，工作曲線方程為y=1.03017x-0.03579，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999631， 其中y 為外標和內(nèi)標峰面積的比值，x 為外標和內(nèi)標濃度的比值，結(jié)果表明，金剛烷胺在1.0μg·kg-1～10μg·kg-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 方法的定量限

采用空白樣品添加低濃度的標準溶液，按1.5、1.6 進行測定，以信噪比S/N≥10 確定金剛烷胺的定量限，為1.0μg·kg-1［5-6］，滿足金剛烷胺藥物殘留的檢測要求。

2.5 準確度和精密度

本方法的準確度通過測定加標樣品的平均回收率來確定，精密度通過計算平均回收率的相對標準偏差來確定。 在稱樣量為2g，加標樣品的添加濃度分別為1、2、10μg·kg-1、每個添加濃度做6 個平行樣品，按1.5、1.6 進行準確度和精密度實驗［7］，平均回收率在80%～112%之間， 相對標準偏差小于10%， 說明該方法具有較高的準確度和較好的精密度，滿足牛奶中金剛烷胺藥物殘留的檢測要求。 添加濃度為2μg·kg-1的加標樣品測得的質(zhì)譜圖，保留時間為145min。 （見圖1）。

圖1 金剛烷胺和氘代金剛烷胺加標溶液質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了牛奶中金剛烷胺的檢測方法，定量限為1.0μg·kg-1， 線性范圍為0.5ng·mL-1～10ng·mL-1，批內(nèi)相對標準偏差小于10%，重復(fù)性較好，滿足牛奶中金剛烷胺的檢測要求。