陳金鋒，姜 蕾，劉國彬

養(yǎng)陰清咽顆粒為安徽省六安市中醫(yī)院放療科特色醫(yī)院制劑，由金銀花、蘆根、玄參、生地、白花蛇舌草等十味中藥組成，方劑組成簡潔，療效明確，具有養(yǎng)陰利咽、清熱生津、解毒散結(jié)、消腫生肌的功能。目前臨床主要用于腫瘤病人放療口咽部位損傷進(jìn)而表現(xiàn)為熱毒傷陰或毒傷血絡(luò)，甚則熱壅肉腐等證。養(yǎng)陰清咽原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制覆蓋面不廣，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，為更全面控制養(yǎng)陰清咽顆粒質(zhì)量，我們采用色譜方法對養(yǎng)陰清咽顆粒中金銀花、玄參、甘草、白花蛇舌草、桔梗五種藥味進(jìn)行定性鑒別，對養(yǎng)陰清咽顆粒中綠原酸進(jìn)行含量測定，進(jìn)一步完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，G1316A紫外檢測器)；BT125D型電子分子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ-5200DA型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；瑞士CAMAG-LINOMA溫度-4手動點(diǎn)樣儀、瑞士CAMAG薄層色譜點(diǎn)樣專用毛細(xì)管、CAMAG紫外觀察箱、YOKO-XR薄層加熱器、高效硅膠G薄層板。

1.2 試藥 養(yǎng)陰清咽顆粒由安徽省六安市中醫(yī)院制劑室提供(批號為20180626、20180823、20180914)；綠原酸對照品、哈巴俄苷對照品、甘草對照藥材、桔梗對照藥材、白花蛇舌草對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院(批號依次為110736-201337、111730-201106、120904-201318、121028-201210、121183-201605)；無水乙醇、甲醇、磷酸、乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、冰醋酸、三氯甲烷、氨水(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；陰性樣品為自制。

2 方法及結(jié)果

2.1 金銀花的鑒別

2.1.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠(Agilent TC-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸(13∶87)，流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液的制備 (1)供試品溶液：取本品適量，研細(xì)，稱取0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇40 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，即得。(2)對照品溶液：精密稱取綠原酸對照品適量，加50%甲醇制成1 mL含80 μg的溶液，即得。(3)陰性對照溶液：按處方比例，稱取除金銀花外的其他12味藥材各一份，按養(yǎng)陰清咽顆粒制備工藝和供試品溶液制備方法制備缺金銀花陰性樣品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 專屬性試驗 取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示在與綠原酸對照品色譜圖相應(yīng)位置上，缺金銀花陰性對照無干擾峰(見圖1)。

2.1.3.2 重復(fù)性驗證 取對照品溶液、3批供試品溶液及陰性對照溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示3批供試品色譜中均檢出綠原酸，方法重復(fù)性較好，因此建議將金銀花納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(見圖2)。

2.2 玄參的鑒別[1]取本品10 g，研細(xì)，加甲醇40 mL，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25 mL使溶解，用乙醚振搖提取3次，每次30 mL，棄去乙醚液，水液用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌4次，每次30 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取哈巴俄苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按供試品制備方法制備缺玄參對照藥材溶液，作為陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015版通則0502)試驗，吸取供試品溶液8 μL，對照品溶液3 μL，陰性對照溶液8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(12∶4∶1)下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰(見圖3)。

2.3 甘草的鑒別[2]取本品10 g，研細(xì)，加甲醇50 mL，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用乙醚萃取3次，每次20 mL，棄去乙醚液，加入水飽和正丁醇20 mL，萃取3次，合并正丁醇液，用正丁醇飽和水洗滌3次，每次20 mL，棄去正丁醇飽和水，水飽和正丁醇液蒸干，加甲醇10 mL使溶解，過10 g中性氧化鋁(100～200目，內(nèi)徑1.5 cm)柱，先用40 mL甲醇洗脫，棄去洗脫液，再用40%甲醇60 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干。殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1 g，加水60 mL，煎煮30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇30 mL，超聲處理使溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1mL使溶解，作為對照品溶液。按供試品制備方法制備缺甘草對照藥材溶液，作為陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015版通則0502)試驗，吸取上述供試品溶液7 μL，對照品溶液3 μL，陰性對照溶液7 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾出，噴以10%硫酸乙醇溶液。在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視(見圖3)。

2.4 白花蛇舌草的鑒別[3]取本品30 g，研細(xì)，加無水乙醇30 mL，浸漬30 min，濾過，濾液濃縮至0.5 mL，作為供試品溶液。另取白花蛇舌草對照藥材3 g，加水50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至約15 mL，加乙醇30 mL，浸漬30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇5 mL使溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照品溶液。按供試品制備方法制備缺白花蛇舌草對照藥材溶液，作為陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015版通則0502)試驗，吸取供試品溶液2～3 μL、對照品溶液2 μL，陰性對照溶液2～3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙醇-濃氨試液(7.5∶7.5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.5 mol/L鹽酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰(見圖3)。

2.5 桔梗的鑒別[4]取本品5 g，加7%硫酸乙醇-水(1∶3)的混合溶液20 mL，加熱回流3 h，放冷，過濾，濾液用三氯甲烷提取2次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，加水洗滌2次，每次30 mL，棄去洗液，三氯甲烷液用無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取桔梗對照藥材1 g，同法制得對照品溶液。按供試品制備方法制備缺桔梗對照藥材溶液，作為陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015版通則0502)試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙醚(1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰(見圖3)。

2.6 綠原酸的測定

2.6.1 色譜條件 同“2.1.1”條件。

2.6.2 溶液制備 (1)供試品溶液制備：取本品適量，研細(xì)，稱取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇40 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。(2)對照品溶液制備：同 “2.1.2”制備方法。(3)陰性對照溶液制備：同“2.1.2”制備方法。

2.6.3 方法學(xué)考察

2.6.3.1 專屬性實驗 操作同“2.1.3.1”項下實驗進(jìn)行，結(jié)果見圖1。

2.6.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取綠原酸對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL至10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。照上述色譜條件，各精密吸取10 μL注入液相色譜儀，每個濃度進(jìn)兩針，記錄峰面積值。以綠原酸進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=2 968.7X-22.077，R2= 0.999 9。表明綠原酸進(jìn)樣量在0.236～2.360 μg之間與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6.3.3 精密度實驗 精密稱定綠原酸對照品1.15 mg至10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，連續(xù)進(jìn)6針，具體見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.6.3.4穩(wěn)定性實驗 取本品適量，研細(xì)，取約2.001 4 g，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，精密加入50%甲醇40 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，做為供試品溶液。分別在0、2、4、6、8、12 h精密吸取供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果表明本品在12 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定，RSD%=0.4%(見表2)。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6.3.5 重復(fù)性實驗 精密稱取樣品6份，分別依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積值。測得綠原酸平均含量分別為1.36、1.37、1.40、1.41、1.36、1.37 mg/g，RSD%=1.53%(n=6)，說明本方法重復(fù)性良好。

2.6.3.6 加樣回收率實驗 取供試品6份，每份約5 g，分別加綠原酸對照品約1.5 mg，按供試品制備方法進(jìn)行制備。分別進(jìn)行液相測定，記錄峰面積值，計算回收率，所得回收率為97.79%，RSD%=1.17%(見表3)。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.6.3.7 樣品含量測定 取6批供試品，按供試品溶液制備的方法制備樣品溶液，結(jié)果表明，養(yǎng)陰清咽顆粒中綠原酸的含量分別為1.45、1.41、1.41、1.35、1.33、1.34 mg/g。

3 討論

高效液相色譜法(HPLC)是目前藥物及制劑常用的一種定量定性方法，該方法適用范圍廣，分析速度快，分離效能高、靈敏度高，在藥物分析及藥品質(zhì)量控制中占有非常重要的地位[5]。色譜柱性能不斷提高，這就要求HPLC配備更高效的檢測器，還可與多種檢測器聯(lián)合應(yīng)用，如HPLC與原子熒光、四級桿飛行時間質(zhì)譜、核磁共振技術(shù)聯(lián)用等[6-8]。

養(yǎng)陰清咽顆粒前期質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完整，為進(jìn)一步完善養(yǎng)陰清咽顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實驗繼續(xù)對養(yǎng)陰清咽顆粒中金銀花、牡丹皮等藥物進(jìn)行色譜鑒別研究。生地黃、牡丹皮背景干擾嚴(yán)重；薏苡仁的色譜鑒別研究發(fā)現(xiàn)，陰性對照有干擾；白及、蘆根的供試品色譜，在與對照品和對照藥材色譜中相應(yīng)位置上無對應(yīng)斑點(diǎn)；金銀花、玄參、甘草、桔梗陰性無干擾，方法重復(fù)性較好，建議將金銀花、玄參、甘草、桔梗納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

實驗初期擬采用薄層色譜法對養(yǎng)陰清咽顆粒中金銀花進(jìn)行鑒別，樣品處理方法復(fù)雜，且效果仍不理想，背景干擾嚴(yán)重，故放棄薄層色譜法，采用HPLC對其進(jìn)行鑒別。養(yǎng)陰清咽顆粒中金銀花色譜鑒別處理方法采用了超聲提取，方法簡單。經(jīng)過多批制劑重復(fù)性實驗及陰性對照實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金銀花鑒別方法操作簡便可行，節(jié)約了時間及成本。

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅通過薄層色譜法對玄參、甘草、桔梗鑒別，鑒別方法單一，不夠全面，本實驗進(jìn)一步以綠原酸作為質(zhì)控指標(biāo)，采用HPLC對金銀花藥味中綠原酸進(jìn)行鑒別，檢驗方法重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，拓寬了養(yǎng)陰清咽顆粒的控制指標(biāo)，較為全面反映養(yǎng)陰清咽顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，進(jìn)一步完善了該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。