張生義，張己為，張旭峰，張 逸，許斌斌，左順慶

近年來，我國的癌癥發(fā)病率和死亡率不斷在增加，癌癥已成為我國居民的主要死亡原因，肺癌的發(fā)病率和死亡率居各類惡性腫瘤之首，其惡性程度高、進(jìn)展快[1]。目前臨床上針對肺癌的治療手段主要以手術(shù)、化療及放療為主，但大部分肺癌病人確診時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，而傳統(tǒng)化療方案療效有限，亦存在耐藥現(xiàn)象，放療不良反應(yīng)較大。因此需探索新的肺癌治療方式。近年來隨著中藥提純技術(shù)的提高，應(yīng)用中藥及其有效成分進(jìn)行綜合治療已成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。華蟾素為干蟾皮經(jīng)科學(xué)方法提取加工制成的水化萃取物，具有清熱解毒、利水消腫等作用，對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，其抗腫瘤的機(jī)制尚未完全明確。本研究以肺癌細(xì)胞株A549為研究對象，探討華蟾素抗肺癌的分子機(jī)制?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 華蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，5毫升/支，批號(hào)041003)。兔抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)(#4060)、兔抗磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)(#4228)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)(#4292)、兔抗蛋白激酶B(AKT)(#4691)、兔抗磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)(#2974)、兔抗哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)(#2972)、兔抗p-S6(#4858)、兔抗S6(#2217)、兔抗磷酸化PTEN(p-PTEN)(#9551)、兔抗PTEN(#9188)、兔抗肌動(dòng)蛋白(β-actin)(#8457)抗體均購自Cell Signaling Technology公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(EMD Millipore公司，#C2035)。人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞株(中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、100 μg/mL青霉素+鏈霉素均購自美國Invitrogen公司。EdU(Sigma公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)試劑盒(碧云天公司)。單人超凈臺(tái)(北京六一儀器廠)；HD-3000 凝膠成像儀(上海上天精密儀器有限公司)；CB15 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549常規(guī)復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、青霉素(100 μg/mL)及鏈霉素(100 μg/mL)的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 CCK8檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化離心后，0.5×104個(gè)/孔的密度種植于96孔板中。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，處理組加入0.2、0.8 μg/mL華蟾素注射液；空白對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液。使用CCK-8檢測不同濃度華蟾素、不同處理時(shí)間(6、12、24、48、72 h)的A549細(xì)胞增殖活力。于時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL CCK8試劑并置于37 ℃孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的吸光度值。計(jì)算均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，運(yùn)用GraphPad軟件繪制時(shí)間依賴生長曲線。

1.2.3 免疫熒光染色 將對數(shù)生長期的細(xì)胞分為對照組、陰性對照組、實(shí)驗(yàn)組，調(diào)整細(xì)密度為1×105/mL，接種于有無菌蓋玻片的24孔板中，37 ℃，5% CO2條件下，培養(yǎng)72 h，根據(jù)EdU染色試劑盒說明書，檢測細(xì)胞增殖。完全培養(yǎng)基稀釋EdU溶液為10 mmol/mL，每孔加入100 μL，孵育4 h后棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，多聚甲醛固定24 h，TBST+驢血清破膜30 min，一抗Ki67過夜孵育，PBST清洗3次，每次10 min，二抗熒光顯色劑Alexa-488+Apollo+DAPI染色試劑孵育1 h，PBST清洗3次，每次10 min，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 胰酶消化并收集華蟾素處理(對照組為等量DMEM培養(yǎng)液)后72 h的A549細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗2次，加入預(yù)冷的含有蛋白酶抑制劑(含1% PMSF、1%氟化鈉、1%釩酸鈉)的細(xì)胞裂解液RIPA，冰浴5～10 min后刮取細(xì)胞至離心管，冰上超聲裂解2 min，12 000 ×g離心后取上清細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，分光光度計(jì)測定蛋白濃度，取總蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳并濕轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。含5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，4 ℃一抗(抗體濃度：p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-S6、S6、p-PTEN、PTEN、β-actin均為1∶1 000)孵育過夜。次日TBST洗膜3次(每次8 min)后，用山羊抗兔二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST洗膜3次(每次8 min)，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Tanon 4500自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描并采用Quantity One軟件進(jìn)行圖像灰度分析，計(jì)算灰度比值，運(yùn)用GraphPad軟件進(jìn)行結(jié)果繪圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和Dunnett-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素抑制肺癌細(xì)胞A549增殖 CCK8法檢測結(jié)果示，與對照組比較，0.2 μg/mL華蟾素作用A549細(xì)胞株48 h后顯示明顯抑制作用(P<0.01)，0.8 μg/mL華蟾素處理12 h后均具有不同程度抑制作用(P<0.05～P<0.01)(見表1)。進(jìn)一步應(yīng)用EdU及Ki67免疫熒光法檢測檢測華蟾素對A549細(xì)胞株增殖的影響(見圖1)，結(jié)果顯示，與對照組比較，0.2、0.8 μg/mL華蟾素作用72 h后，A549細(xì)胞增殖均受到抑制(P<0.05～P<0.01)(見表2)。

表1 CCK8法檢測對照組和華蟾素處理組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況

表2 Ki67、EdU檢測對照組和華蟾素處理組細(xì)胞增殖情況

2.2 華蟾素下調(diào)PTEN/AKT/mTOR通路活性 0.2、0.8 μg/mL華蟾素作用于細(xì)胞72 h后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6、p-PTEN表達(dá)量均較對照組下降(P<0.05～P<0.01)，而PI3K、AKT、mTOR、S6及PTEN表達(dá)量與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖2、表3)。

續(xù)表2

表3 對照組和華蟾素處理組AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

3 討論

華蟾素是中華大蟾蜍的干燥表皮的水化萃取物，其主要成分是吲哚生物堿類、嘧啶類以及生物堿等，具有清熱解毒、消炎、強(qiáng)心、利水消腫、抗病毒、止痛等作用[2]。華蟾素還具有抗癌功效,可明顯抑制肺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等多種癌細(xì)胞的生長[3-4]。本研究結(jié)果表明華蟾素可以以時(shí)間及劑量依賴方式抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，與既往研究[5-6]結(jié)果一致。

在腫瘤組織中，腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白磷酸化水平往往表達(dá)異常，這與癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲性明顯相關(guān)[7]。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)增強(qiáng)可影響腫瘤細(xì)胞的增殖能力，抑制凋亡發(fā)生[8]。PTEN是PI3K/AKT傳導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)控因子，其可去磷酸化PIP3，產(chǎn)生PIP2，從而終止PI3K介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。在本研究中，華蟾素可以明顯的降低A549細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6的表達(dá)量，而對PI3K、AKT、mTOR、S6的表達(dá)量沒有明顯影響。這說明華蟾素可能是通過抑制腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白磷酸化而抑制A549增殖。既往研究[10]發(fā)現(xiàn)在癌組織中，PTEN主要通過基因突變、雜合性丟失、甲基化等方式失活而造成表達(dá)量異常。此外，研究[11-12]表明PTEN的翻譯后修飾還包括磷酸化、氧化、和蛋白結(jié)合等，其中以磷酸化最為重要。在本研究中，華蟾素明顯降低p-PTEN的表達(dá)量，這進(jìn)一步說明華蟾素可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路上游信號(hào)蛋白PTEN的磷酸化，進(jìn)而進(jìn)一步抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白磷酸化而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。

綜上，華蟾素可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白磷酸化，抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖。