楊 碩，陳天天，王文銳，楊清玲，陳昌杰

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]，也是女性惡性腫瘤病人第二大死亡原因，化療耐藥是造成病人生存期逐漸縮短的重要原因。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是本身不具有編碼蛋白質功能的RNA分子，早期發(fā)現(xiàn)時被認為是“轉錄噪音”。近年來隨著非編碼RNA研究領域的拓展，人們逐漸認識到LncRNA 在越來越多的癌癥中發(fā)揮重要的原癌基因或抑癌基因作用[2-3]。其通過與各種生物大分子如DNA、蛋白質和RNAs相互作用，參與多種細胞或者生物進程。近年來的研究[4]表明，LncRNA在人類多種癌癥中異常表達，具有細胞和組織特異性。LncRNA參與調控腫瘤的發(fā)生、增殖、凋亡和侵襲及轉移等過程[5-6]。目前越來越多的研究[7-9]發(fā)現(xiàn)LINC00173在不同癌癥中發(fā)揮著不同的調控作用，如LncRNA LINC00173在宮頸癌、結直腸癌及乳腺癌中發(fā)揮著抑癌的作用，而在黑素瘤中充當著癌基因的角色。有研究[10]表明LINC00173在調控細胞的耐藥性及血管生成方面產生重要作用，但是對其細胞的增殖、侵襲等研究較少。本研究就LINC00173在乳腺癌細胞株中的表達及相關機制進行研究，為進一步提供化療預后評估生物標志物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 正常乳腺上皮細胞株MCF-10A和乳腺癌細胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231購自中國科學院細胞庫；胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；Trizol試劑和Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑購自Takara公司；LncRNA LINC00173慢病毒過表達載體及干擾片段購自上海吉瑪公司；所有引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；一抗CyclinD1、β-catenin、P-gp及二抗購自Proteintech公司；CCK8試劑盒購自吉瑪公司；Transwell小室購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用紫杉醇誘導MCF-7細胞耐藥性的產生，使MCF-7細胞處于10 μg/mL的濃度中穩(wěn)定生長。乳腺癌細胞株均接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2和95%飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至融合度80%左右后進行傳代培養(yǎng)。所有實驗均取對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 qRT-PCR檢測乳腺癌細胞株LINC00173的表達 采用Trizol法提取各乳腺癌細胞株總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑說明書進行逆轉錄，按照熒光定量試劑盒說明書進行PCR實驗。GAPDH作為內參，所用的引物序列見表1。qRT-PCR反應參數(shù)為95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，40個循環(huán)。獲得的數(shù)據(jù)運用2-ΔΔCt計算表達量。

表1 引物序列

1.2.3 過表達細胞株的構建 收集對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后接種(3～5)×103個細胞于96孔板，設置不同梯度的感染復數(shù)(MOI)值，分別為1、5、10、50、100，加入相應的病毒量后放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后更換新鮮培養(yǎng)基；96 h后觀察熒光表達情況，以確認目的細胞的感染方法和感染指數(shù)。取對數(shù)生長期細胞消化后重懸，取2×105/mL細胞接種至6孔板中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取陰性對照和目的病毒按照相應MOI值的病毒量與培養(yǎng)基混合，加入終濃度5 μg/mL的Polybrene，37 ℃培養(yǎng)；24 h后加入新鮮培養(yǎng)基，48 h后熒光倒置顯微鏡下觀察并記錄結果。

1.2.4 轉染LINC00173干擾片段 收集對數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液均勻接種于6孔板中，放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當細胞匯合度達到70%～90%時分別加入5 μL陰性對照組和干擾片段組和250 μL Opti-MEM輕柔混勻，室溫放置5 min，5 μL Lipofectamine2000稀釋于250 μLOpti-MEM輕柔混勻，室溫放置5 min，將稀釋后的Lipofectamine2000與干擾片段混勻，室溫放置20 min，用PBS洗滌，加入1.5 mL無血清的培養(yǎng)基，將混合物緩慢加到6孔板中，24～48 h后篩選出效果最佳的干擾片段。LINC00173干擾片段序列為5′-CUC CUA UUC ACC CUU CAG ATT-3′；5′-UCU GAA GGG UGA AUA GGA GTT-3′。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞的增殖活性 按照Cell-Counting Kit-8細胞增殖檢測的說明書進行，細胞消化接種至6孔板(1×105個/孔))，分別將實驗組、對照組的質粒轉染至細胞中，培養(yǎng)48 h后，細胞消化離心至96孔板(2 000個/孔)，每組設立3個復孔。分別在0、24、48、72 h時，加入CCK-8試劑(10 μL/孔)，2 h后分別檢測各孔的吸光度(450 nm)。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞的遷移能力 胰酶消化對數(shù)生長期細胞，離心將細胞制成單細胞懸液接種于6孔板中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至80%左右匯合時，用10 μL無菌槍頭在細胞板中央輕輕劃出一道傷口，注意保持各組劃出的傷口寬度基本一致，用PBS清洗2次，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)放于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后在低倍鏡下觀察各組細胞的遷移結果。

1.2.7 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力 胰酶消化對數(shù)生長期細胞，用無血清培養(yǎng)基將每組的細胞調整到相同細胞密度。按照實驗分組，各組配置100 μL加入Transwell小室的上室。Transwell小室的下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽小心擦去Transwell小室上室的培養(yǎng)基以及膜上部未穿過的細胞，4%多聚甲醇固定20 min，吉姆薩染液染色，倒置顯微鏡隨機計數(shù)5個高倍鏡視野下細胞數(shù)目并拍照記錄。

1.2.8 Western blotting法檢測CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白的表達 收集轉染干擾片段的MCF-7細胞及過表達LINC00173處于對數(shù)生長期的MCF-7/PR耐藥細胞，加入RIPA 裂解液，冰浴30 min，4 ℃條件下經12 000 r/min離心30 min，提取細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻后點樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜、封閉，加入CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，洗膜，加入二抗稀釋液(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL顯影，應用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用方差分析、q檢驗和t(或t′)檢驗。

2 結果

2.1 人乳腺癌細胞株MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231和SKBR-3中LINC00173表達水平比較 qRT-PCR結果顯示，相對于正常人乳腺上皮細胞系MCF-10A，LINC00173在3種乳腺癌細胞系中相對低表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表2)。

表2 在MCF-10A、MCF-7 、MDA-MB-231和SKBR-3細胞中LINC00173表達水平比較

2.2 siRNA下調乳腺癌細胞系MCF-7中LINC00173水平 為進一步研究LINC00173在乳腺癌中的作用，特異性的si-LINC0013被轉入到MCF-7中，非特異性的siRNA作為陰性對照(si-NC)。與si-NC組相比，si-LINC00173組的LINC00173表達量明顯降低(P<0.01)(見表3)。

表3 si-LINC00173對MCF-7細胞LINC00173表達的影響

2.3 過表達LINC00173對乳腺癌耐藥細胞MCF-7/PR中LINC00173表達的影響 為評估LINC00173在乳腺癌細胞中的作用，LV-LINC00173載體轉入到MCF-7/PR細胞中，以陰性對照(LV-NC)組為對照。與陰性對照組相比，過表達LV-LINC00173載體組LINC00173的表達量升高(P<0.01)(見表4)。

表4 LV-LINC00173對MCF-7/PR細胞LINC00173表達的影響

2.4 LINC00173對乳腺癌細胞增殖的影響 為探討LINC00173在乳腺癌細胞中的生物學作用，利用CCK8法檢測細胞的增殖能力，結果顯示，與si-NC轉染組相比，si-LINC00173轉染組明顯促進MCF-7細胞的增殖(P<0.01)(見表5)；與LV-NC組相比，LV-LINC00173組明顯抑制細胞的增殖(P<0.01)(見表6)。

表5 si-LINC00173對MCF-7細胞的增殖促進作用

表6 LV-LINC00173對MCF-7/PR細胞的增殖抑制作用

2.5 LINC00173表達對乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力的影響 與si-NC組相比，通過劃痕實驗結果發(fā)現(xiàn)，si-LINC00173的遷移率明顯上升(見圖1)。Transwell實驗結果表明,si-LINC00173侵襲的細胞數(shù)明顯增加(P<0.01)(見圖2、表7)。而上調LINC00173表達后，LV-NC組相比，LV-LINC00173侵襲的細胞與遷移能力明顯降低(見圖3、4、表8)。

表7 si-LINC00173對MCF-7細胞遷移能力的影響

表8 LV-LINC00173對MCF-7/PR細胞遷移能力的影響

2.6 LINC00173對CyclinD1、β-catenin、P-gp的影響 Western blotting結果顯示，與si-NC組相比，si-LINC00173的CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白水平明顯升高(見圖5，表9)。而相對于陰性對照(LV-NC)組，過表達LINC00173后，乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/PR的CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白表達量顯著降低(P<0.01)(見圖6、表10)。

表9 si-LINC00173對MCF-7細胞的CyclinD1、β-catenin、P-gp的影響

表10 LV-LINC00173對MCF-7/PR細胞的CyclinD1、β-catenin、P-gp的影響

3 討論

LncRNA是一類長約200個核苷酸的非編碼RNA，在非編碼RNA中所占比例最高，廣泛存在于人體正常組織中[11-12]，在轉錄或轉錄后水平發(fā)揮基因調控作用，參與細胞的增殖、分化、凋亡、轉移等多種生物學行為[13-14]。近年來的研究[15-17]表明，越來越多的lncRNA，如SOX2OT、BCRT1、AFAP1-AS1等與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關，涉及細胞中的多種分子和信號通路。LINC00173在乳腺癌中的作用研究報道目前尚少。

LINC00173位于細胞核內的12號染色體，參與了腫瘤的形成與發(fā)展，LINC00173在許多腫瘤中發(fā)揮著抑癌作用，調控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。ZENG等[18]研究證明，LINC00173在非小細胞肺癌中的表達顯著降低，與腫瘤的大小和分化程度有關，體外過表達LINC00173后抑制了癌細胞的轉移[19]。FAN等[20]研究指出，在腫瘤細胞中，上調LINC00173后，乳腺癌細胞增殖活性顯著降低，β-catenin、P-gp、CyclinD1蛋白水平降低，提示LINC00173的表達可能通過下調β-catenin的表達從而抑制乳腺癌細胞的增殖。雖然對LINC00173的研究很多，但其在乳腺癌中的作用研究較少。

LINC00173可能通過多種方式在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮作用。有研究[21]表明，在粒細胞分化和早期髓系祖細胞或前體與EZH2的相互作用中產生作用，進而促進腫瘤的形成；YU等[8]研究發(fā)現(xiàn) LINC00173可以與PLP2蛋白相互作用，下調LINC00173，降低PLP2蛋白，減少對細胞周期的阻斷作用，從而促進細胞增殖；ZHAO等[22]研究表明，LINC00173可能通過一些靶基因調控癌癥的進展和耐藥，比如FBXW7、Ekt等。另有報道[23]LINC00173在腫瘤的增殖、侵襲及轉移中的作用，但在乳腺癌中與增殖、轉移的關系報道很少。

為進一步闡明LINC00173在乳腺癌中的作用機制，本研究比較了3株乳腺癌細胞株LINC00173的表達量。結果發(fā)現(xiàn)LINC00173在乳腺癌細胞株中相對低表達，根據(jù)數(shù)據(jù)庫分析LINC00173在MCF-7細胞中主要分布于細胞核內，因此在后續(xù)實驗中用MCF-7細胞及MCF-7/PR耐藥細胞株進行研究。在MCF-7細胞中下調LINC00173的表達，乳腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力明顯增加。相反，在MCF-7/PR細胞中上調LINC00173的表達，乳腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力明顯下降，表明LINC00173可能會調控乳腺癌細胞的發(fā)展進程。這些結果表明LINC00173在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著抑癌的作用，它的缺失與過表達可能引起乳腺癌。綜上所述，上調LINC00173在乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用；可能通過β-catenin信號通路，抑制乳腺癌耐藥細胞的侵襲和轉移能力。但目前的研究較淺，LINC00173在腫瘤的轉移中的調控作用還需進一步研究，為臨床開發(fā)腫瘤標志物及靶向藥物提供新的方向。