郭秉楠，燕憲亮，許 鐵

食管癌作為消化道系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，由于其高侵襲性和低存活率，5 a生存率僅為10%～15%，其發(fā)生率在人類所有惡性腫瘤中列第八位，死亡率列第六位[1-3]。由于人們的健康意識以及檢測條件的限制，大量原發(fā)食管癌患者初診時已發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移[4]。近年來，隨著對食管癌發(fā)生發(fā)展機理的深入研究，越來越多的治療靶點被發(fā)現(xiàn)，但是有效且安全的治療靶點對食管癌的預后仍不甚理想。因此，尋找參與食管癌發(fā)生和轉移相關的分子標志物及治療干預靶點，對于指導治療、提高患者生存率具有重要的意義。

磷酸甘油酸變位酶/蛋白家族5 (PGAM5,phosphoglycerate mutase/protein family member)是一個非典型的線粒體絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，與磷酸甘油酸變位酶同源，但缺乏相應的酶催化功能，最初發(fā)現(xiàn)與Bcl-xL相互作用[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，PGAM5調節(jié)多重細胞死亡通路，包括凋亡和壞死[6-7]。例如PGAM5與Bcl-xL調節(jié)低氧誘導下的線粒體自噬，從而控制細胞凋亡。目前關于PGAM5在腫瘤中的作用研究較少，主要集中于肝癌和彌散性大B淋巴細胞瘤，均發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織中顯著升高，但在食管癌中的生物學作用尚不明確[8-9]。本研究通過小干擾RNA技術，在體外探討PGAM5對食管癌細胞增殖與轉移能力的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑人食管上皮細胞系HEEC及人食管癌細胞系KYSE150購自中科院細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；小干擾RNA(PGAM5:5’-AGTCAGAAGGGTTGGCCAA-3’)、對照小干擾RNA(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’)購自上海吉瑪公司； Lipofectamine 2000轉染試劑購自Thermo Fisher公司；抗PGAM5、Bcl-xL 和MMP2抗體購自CST公司；β-actin抗體購自Santa Cruz；CCK-8購自碧云天公司；Annexin V-FITC和PI購自Biolegend公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉染人食管正常上皮細胞HEEC及食管癌細胞系KYSE150培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。兩種細胞系在含5%二氧化碳的37 ℃的培養(yǎng)箱中備用。在轉染特異性siRNA及對照siRNA前一天取對數生長期的細胞系各5×105個細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細胞生長到60%密度時，按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染。

1.2.2 細胞增殖實驗取轉染后的人食管癌細胞系KYSE150鋪于96孔培養(yǎng)板中，每空4 000個細胞，每孔加完全培養(yǎng)基200 μL后置于含5%二氧化碳的37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，分別取24、48、72、96 h時間點棄培養(yǎng)基，加入新鮮無血清培養(yǎng)基100 μL、CCK8溶液10 μL，充分混勻后加入96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，酶標儀測OD450值。

1.2.3 細胞凋亡實驗取1×106轉染后的KYSE150細胞放置于流式管中，500 μL 流式緩沖液(含0.5%FBS的PBS)洗1遍，100 μL流式緩沖液重懸細胞并加入3 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，輕輕混勻后4 ℃避光孵育30 min，500 μL 流式緩沖液洗2遍，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 細胞劃痕實驗人食管癌細胞系KYSE150轉染siRNA 48 h后，用200 μL黃色移液器吸頭，利用直尺在6孔板底部劃1條等距離平行線，用PBS輕輕洗去滑落的細胞，用維持培養(yǎng)基(含1%胎牛血清)在37 ℃的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、12、24、48 h用電子顯微鏡采集圖像，觀察細胞遷移情況。細胞劃痕實驗相對定量通過image J軟件進行。

1.2.5 Transwell實驗侵襲實驗在Transwell小室上層均勻鋪40 μL含基質膠的培養(yǎng)基，置于37 ℃的培養(yǎng)箱備用。每空4 000個轉染后的細胞加入上室中后加入200 μL培養(yǎng)基，Transwell下層加含15%胎牛血清的培養(yǎng)基800 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。培養(yǎng)結束后，90%甲醇固定15 min，結晶紫染色15 min，PBS漂洗2次，電子顯微鏡采集圖像，觀察細胞侵襲情況。細胞侵襲實驗相對定量通過image J軟件進行。

1.2.6 免疫印跡實驗轉染后的正常人食管上皮細胞及食管癌癌細胞系裂解液50 μg于上樣緩沖液中100 ℃煮10 min后進行SDS-PAGE電泳。電泳2 h后，轉印到PVDF膜上；一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜后，TBST漂洗3次，每次10 min；二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h后，TBST漂洗3次，每次10 min；化學發(fā)光(electro chemilamines cence,ECL)儀中進行拍照并分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 兩種細胞系PGAM5的表達通過Western blotting實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與人食管上皮細胞系HEEC相比，KYSE150細胞系的PGAM5蛋白的表達水平顯著高于HEEC細胞系，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)，提示食管癌細胞中PGAM5蛋白可能異常高表達。

①P<0.05。

2.2 siRNA干擾食管癌細胞系后對PGAM5、Bcl-xL 、MMP2蛋白表達的影響siPGAM5轉染食管癌細胞系KYSE150 48 h后，Western blotting檢測PGAM5、Bcl-xL、MMP2蛋白在KYSE150細胞系中表達的變化，發(fā)現(xiàn)與siCtrl組相比，siPGAM5組PGAM5蛋白表達量顯著降低，同時發(fā)現(xiàn)Bcl-xL、MMP2蛋白表達水平也顯著降低。提示干擾PGAM5后，可以降低抗凋亡蛋白Bcl-xL的穩(wěn)定性，同時降低遷移與黏附相關蛋白相關MMP2的表達(圖2)。

①P<0.05。

2.3 siRNA干擾PGAM5后對食管癌細胞系增殖和凋亡能力的影響通過CCK8實驗分析發(fā)現(xiàn)：與siCtrl組相比，siPGAM5組細胞增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3A)；通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)：與siCtrl組相比，siPGAM5組細胞凋亡能力顯著增高(圖3B、C)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示干擾PGAM5可以抑制KYSE150細胞系增殖并促進其凋亡。

A：CCK8檢測細胞增殖；B、C：流式細胞術檢測細胞凋亡。①P<0.05。

2.4 siRNA干擾PGAM5后對食管癌細胞系轉移能力的影響通過劃痕實驗發(fā)現(xiàn)：與siCtrl組相比，siPGAM5組在48 h后的遷移能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4A)，提示干擾PGAM5可以抑制KYSE150細胞系的遷移能力。同時通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)：siPGAM5組細胞侵襲數量明顯低于siCtrl組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示干擾PGAM5可以抑制KYSE150細胞系的侵襲能力(圖4B)。

A：劃痕實驗檢測細胞遷移；B：Transwell實驗檢測細胞侵襲。①P<0.05。

3 討論

PGAM5作為線粒體膜上的蛋白，可通過多種細胞壞死性通路參與多種細胞內活動。許多研究表明，細胞的凋亡和壞死會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如抗凋亡基因Bcl-xL在肝癌、乳腺癌、膠質瘤等多種腫瘤中促進腫瘤的發(fā)生[10-12]。PGAM5作為一種新發(fā)現(xiàn)的與Bcl-xL相互作用的蛋白在肝損傷、肺纖維化及心臟損傷中發(fā)揮重要作用[13-16]，但在腫瘤中的作用知之甚少。本研究首次發(fā)現(xiàn)了PGAM5在人食管癌細胞系中的作用。

本研究首先通過與正常人食管上皮細胞系比較發(fā)現(xiàn)，人食管癌細胞系KYSE150的PGAM5蛋白表達水平異常升高。通過siRNA技術干擾人食管癌細胞系中PGAM5蛋白的表達后發(fā)現(xiàn)Bcl-xL蛋白的表達亦下調，與之前報道的肝癌中的結果相一致[8]，提示干擾PGAM5可以抑制細胞增殖。進一步發(fā)現(xiàn)干擾PGAM5后，MMP2蛋白表達量隨之降低。作為一種金屬基質蛋白酶，MMP2是降解基底膜和細胞外基質的關鍵酶之一[17]，提示抑制PGAM5蛋白表達后，可以阻止食管癌細胞突破基底膜，從而抑制食管癌細胞的轉移。為了證實上述Westren blot實驗結果和本實驗假說，進一步通過CCK-8實驗，細胞劃痕實驗以及Transwell實驗驗證。實驗結果表明，抑制PGAM5后，KYSE150細胞的增殖和轉移能力均顯著降低。

綜上所述，雖然目前對食管癌的治療仍存在困難，但是隨著對其發(fā)生發(fā)展機制了解的更為深入，越來越多的靶點被發(fā)現(xiàn)。本研究提示，PGAM5可能通過調節(jié)Bcl-xL和MMP2的表達，進而調節(jié)食管癌細胞的增殖與轉移，但更為詳盡的機制還需進一步研究。