曾維星, 程 賢, 張笮晦, 畢良武*, 趙振東

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室;國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學工程重點實驗室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室;江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210042; 2.廣西中醫(yī)藥大學 藥學院;廣西中藥藥效研究重點實驗室,廣西 南寧 530200; 3.廣西庚源香料有限責任公司, 廣西 東興 538100)

Waksman和Cordon在1939年第一次利用微生物處理苜蓿(MedicagosativaLinn.)，揭開了生物預處理研究的序幕[1]。早先對生物預處理的研究主要包括微生物的篩選、生物預處理的工藝優(yōu)化[2]、生物預處理的作用機制研究[3]以及生物預處理的應用。隨著生物預處理研究的發(fā)展，不斷涌現(xiàn)出微生物發(fā)酵技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應用[4]。以微生物發(fā)酵技術(shù)為預處理手段應用于天然產(chǎn)物的提取主要利用了微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生纖維素酶等多種細胞壁水解酶，從而提高了天然產(chǎn)物提取率[5-7]。其中，生物酶是微生物發(fā)酵技術(shù)應用于天然產(chǎn)物提取的關(guān)鍵。伴隨著生物酶商業(yè)化生產(chǎn)的實現(xiàn)，生物酶輔助技術(shù)也被廣泛用于天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域[8-11]。作者綜述了微生物發(fā)酵技術(shù)和生物酶處理技術(shù)2種生物預處理技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的作用機制和實際應用，旨在顯著提升天然產(chǎn)物開發(fā)利用的技術(shù)水平，為實現(xiàn)肉桂(CinnamomumcassiaPresl)、油樟(Cinnamomumlongipaniculatum(Gamble) N. Chao ex H.W. Li)等具有中國特色的大宗天然資源的高效提取與利用研究提供參考。

1 生物預處理技術(shù)

1.1 微生物發(fā)酵技術(shù)

1.1.1發(fā)酵類型

1.1.1.1液態(tài)發(fā)酵 液態(tài)發(fā)酵首先是將原料粉碎后制備成液體培養(yǎng)基，然后將微生物菌株接種在培養(yǎng)基中，發(fā)酵液供分離提取。液態(tài)發(fā)酵技術(shù)具有菌體生長快速、生產(chǎn)周期短、宜于工業(yè)化生產(chǎn)、無季節(jié)性等特點。目前液態(tài)發(fā)酵技術(shù)多運用于抗生素、黃酮等天然產(chǎn)物提取的預處理階段。辛燕花課題組[12-13]以靈芝作為菌株，采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)處理銀杏葉，研究結(jié)果表明靈芝多糖和黃酮分別提高了1.98 倍和2.35倍；以靈芝作為菌株，在30 mL基礎(chǔ)發(fā)酵液、何首烏添加量為0.15 g、添加時間為發(fā)酵第3天、初始pH值8.0、發(fā)酵時間9 d，在此條件下靈芝總黃酮產(chǎn)量為20.74 mg/g，相比對照靈芝菌絲體(未添加何首烏)提高了3.23倍。

1.1.1.2固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵技術(shù)是將待提取原料直接作發(fā)酵基質(zhì)或粉碎后作為發(fā)酵基質(zhì)，利用1種或多種真菌為發(fā)酵菌種進行發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵的區(qū)別主要在于固態(tài)發(fā)酵體系含水量低且為自然發(fā)酵。因此固態(tài)發(fā)酵周期較長，過程復雜，缺乏質(zhì)量控制指標，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，其優(yōu)點在于成本低廉。王吉成等[14]以冠突散囊菌為發(fā)酵菌種，對桑葉進行固態(tài)發(fā)酵，最后使用體積分數(shù)70%乙醇進行提取，研究表明：發(fā)酵后桑葉提取物的總黃酮含量高于未發(fā)酵的桑葉總黃酮含量，對Fe2+的螯合能力顯著升高。李季文等[15]對黃芪-女貞子進行真菌固態(tài)發(fā)酵，成功富集了黃芪多糖。

1.1.2發(fā)酵原理 微生物發(fā)酵技術(shù)作為天然產(chǎn)物提取的生物預處理方式之一，其原理是借助微生物在適當條件下對提取原料進行發(fā)酵處理，微生物生長代謝過程會產(chǎn)生豐富的生物酶，包括淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等，進而破壞植物原料的細胞壁。Brunecky等[16]研究表明厭氧真菌可以分泌高活性的纖維素酶、半纖維素酶、纖維小體等，可以協(xié)同分解利用結(jié)構(gòu)復雜的纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)。這些高活力的生物酶是導致植物細胞壁降解、細胞間隙增加的有力工具。Wang等[17]研究表明厭氧真菌可以通過假根系統(tǒng)破壞細胞壁結(jié)構(gòu)使其變疏松，從而易于被其他微生物和水解酶降解。因此，發(fā)酵技術(shù)作為天然產(chǎn)物提取的預處理手段有助于促進植物有效成分的釋放及其在提取介質(zhì)中的擴散，從而增加了天然產(chǎn)物的提取效率，其作用機制如圖1所示。

圖1 發(fā)酵技術(shù)的作用機制Fig.1 Mechanism of fermentation technology

1.1.3影響因素 在實際應用中，由于發(fā)酵菌種種類復雜，各種菌種代謝利用的物質(zhì)各不相同。為了發(fā)揮發(fā)酵技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的優(yōu)勢，菌種的選擇是關(guān)鍵。選擇菌種時要考慮菌種的遺傳性能可以保持穩(wěn)定；菌種本身無毒，也不會產(chǎn)生有毒物質(zhì)；菌種與天然產(chǎn)物共存時能正常生長。其次，菌種數(shù)量和發(fā)酵溫度、濕度、含氧量等環(huán)境因素對發(fā)酵過程都會產(chǎn)生較大影響。柏倩等[18]在進行銀杏葉發(fā)酵工藝優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，溫度和接種量對發(fā)酵過程的影響極顯著，pH值和發(fā)酵溫度對發(fā)酵過程的影響具有交互作用。同時發(fā)酵技術(shù)能否實現(xiàn)規(guī)范化、工業(yè)化應用還依賴于質(zhì)量控制指標的科學性。

1.2 生物酶處理技術(shù)

1.2.1作用機制 生物酶破壞植物細胞壁的實質(zhì)主要在于對纖維素的水解作用?；赗eese等[19]在1950年提出的C1-Cx假說。Wood等[20]在1986年提出了內(nèi)切和外切葡聚糖酶協(xié)同作用模型(圖2)，將水解過程分成4步：1) 內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶通過協(xié)同作用共同作用于纖維素表面[21]；2) 內(nèi)切葡聚糖酶通過水解β-1,4-葡萄糖苷鍵，截斷纖維素產(chǎn)生新的多糖鏈末端；3) 外切葡聚糖酶在多糖鏈末端水解β-1,4-葡萄糖苷鍵，進一步切割多糖鏈產(chǎn)生纖維二糖；4)β-葡萄糖苷酶作用于纖維二糖等寡聚糖，最終將纖維素降解為葡萄糖[21-23]。然而，成熟的植物細胞中也有木質(zhì)素，部分生物酶可降解木質(zhì)素，如白腐真菌分泌的胞外木質(zhì)素降解酶結(jié)合白腐真菌自身產(chǎn)生的H2O2觸發(fā)一系列自由基鏈反應可以氧化降解木質(zhì)素[24-27]，乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶和甲醇氧化酶也參與木質(zhì)素降解，但是目前其作用機制尚不明確[28]。

圖2 內(nèi)切和外切葡萄糖酶協(xié)同作用模型Fig.2 In-line and exo-glucose synergy model

1.2.2協(xié)同預處理 生物酶預處理技術(shù)同其他物理化學預處理技術(shù)組合成協(xié)同體系，可以達到高效率降解纖維素的效果。通常情況下，物理化學預處理先于生物酶預處理，先將纖維素的致密物理結(jié)構(gòu)損壞，伴隨著纖維出現(xiàn)斷裂或孔洞，其剛性及有序性降低，有助于生物酶在后期處理中占據(jù)位點。高大維等[29]采用冷凍預處理協(xié)同酶法提取靈芝中的多糖成分，提取液中多糖為1.05%，顯著優(yōu)于酶法提取(0.87%)。組合預處理協(xié)同技術(shù)具有良好的應用前景，其組合多樣性有很大的開發(fā)空間，但其作用條件有待進一步研究和優(yōu)化。

2 生物預處理技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應用

2.1 微生物發(fā)酵技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應用

2.1.1揮發(fā)性成分的提取 魏文浩等[30]對番石榴葉進行固態(tài)發(fā)酵處理的研究表明：紅曲霉菌發(fā)酵番石榴葉促進了植物細胞中結(jié)合性多酚的釋放以及黃酮糖苷的水解，大大提高了總黃酮和總酚含量，同時使得有刺激性氣味的植物醇和β-石竹烯含量下降。李軍集等[31]以桂葉渣為原料進行液態(tài)發(fā)酵的研究顯示：發(fā)酵后桂葉渣的化學成分發(fā)生明顯變化，產(chǎn)生了其他具有揮發(fā)性芳香氣味的化學成分，如乙酸乙酯、己酸丁酯、δ-蓽澄茄烯等，使無味的桂葉渣具有了芳香氣味，并且發(fā)酵作用能夠有效地降解桂葉渣中的粗纖維。梁開朝等[32]利用微生物菌株M-5對K326煙葉進行發(fā)酵處理后，煙葉提取物中苯乙醇、丁酸乙酯等天然香精、精油成分顯著提高。該研究表明M-5菌株不僅可以進一步用于煙葉純化，還具有生產(chǎn)香精香料的能力。張笮晦等[33]利用微生物菌株XJ26的發(fā)酵液處理肉桂葉成功提取了肉桂醛等桂葉精油成分，并且在最優(yōu)工藝條件下，肉桂醛、香豆素和鄰甲氧基肉桂醛的得率分別為1.40%、0.73% 和0.92%，其中甲氧基肉桂醛的含量得率高于常規(guī)水蒸氣蒸餾法(0.11%)[34]。

2.1.2非揮發(fā)性成分的提取 天然產(chǎn)物中的非揮發(fā)性成分往往存在結(jié)構(gòu)復雜、含量低的特點，因此傳統(tǒng)提取方式無法滿足天然產(chǎn)物開發(fā)的需求。隨著生物技術(shù)的日益發(fā)展，發(fā)酵技術(shù)為解決這一問題提供了幫助。蘇貴龍等[35]采用非解乳糖鏈球菌FGM對黃芪的根、莖和葉進行發(fā)酵處理，研究表明該發(fā)酵技術(shù)可顯著提高黃芪根和莖中活性多糖、皂苷和黃酮的提取率?；檐遊36]用紅曲霉等對刺五加葉進行固態(tài)發(fā)酵配合超聲波輔助提取技術(shù)從刺五加葉中提取黃酮，研究表明黃酮質(zhì)量分數(shù)較發(fā)酵前提高32.37%。劉超等[37]使用酵母菌發(fā)酵黃芪后進行提取，發(fā)現(xiàn)酵母菌發(fā)酵處理后提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度為0.89 g/L，相對于傳統(tǒng)水煎法有一定程度的提高。孫海等[38]利用復合酶解-酵母發(fā)酵對毛木耳進行預處理，回流提取毛木耳多糖得率為3.43%。

2.1.3毒性成分的降解 天然產(chǎn)物提取過程中伴隨著毒性成分的產(chǎn)生，包括毒性生物堿、毒性內(nèi)酯、刺激性芳香羧酸等。微生物發(fā)酵過程會將部分有毒成分分解轉(zhuǎn)化，從而降低天然產(chǎn)物的毒副作用。王身艷[39]研究表明扇菇菌液態(tài)發(fā)酵草烏，促使劇毒的烏頭堿、中烏頭堿以及次烏頭堿含量明顯降低，從而降低提取物毒性。邱海龍[40]使用扇番菌發(fā)酵番荔枝子，使提取液中鄰雙四氫呋喃內(nèi)酯的含量降低，間雙四氫呋喃內(nèi)酯的含量升高，從而降低整體毒性。

2.1.4高活性成分的產(chǎn)生 在發(fā)酵預處理過程中，微生物自身代謝產(chǎn)物會直接作用于部分天然產(chǎn)物，將其分解或修飾從而產(chǎn)生新的高活性化合物。因此，發(fā)酵技術(shù)能起到提高天然產(chǎn)物生物活性的效果。潘揚等[41]研究了馬錢子經(jīng)朱紅栓菌固態(tài)發(fā)酵后提取所得主要生物堿的化學成分，研究發(fā)現(xiàn)：相較于未經(jīng)發(fā)酵提取液，經(jīng)發(fā)酵預處理的提取液中新增了4種成分，利用化學結(jié)構(gòu)可以推斷新增成分為原有吲哚生物堿衍生而來；新增成分不僅保持了原型化合物的抗炎活性，且使其毒性明顯降低。

2.2 生物酶預處理技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應用

潘映橋等[42]以響應面法優(yōu)化了酶輔助水蒸氣蒸餾法提取千層金精油的工藝。該研究通過果膠酶和纖維素酶的協(xié)同作用，分解千層金的細胞壁而釋放出植物精油，將千層金精油得率從0.91%(水蒸氣蒸餾法)提高至3.96%，解決了千層金精油水蒸氣蒸餾提取法產(chǎn)率低的弊端。張雪松等[43]采用β-葡萄糖苷酶-果膠酶復配對桂花進行酶處理，然后采用溶劑法提取桂花精油。該方法使精油得率相比未加酶的1.77%提高了55.37%，所得桂花精油的有效成分種類也同步增加，解決了水蒸氣蒸餾法高溫破壞植物細胞熱敏感成分的問題。叢贏[44]利用酶輔助提取油樟精油的研究表明混合酶預處理的油樟葉片下表皮表面損傷嚴重，氣孔幾乎不可見，因此減少了有效成分溶出阻力，對細胞壁的破壞更加徹底，使得酶輔助-水蒸氣蒸餾法提取油樟精油的得率(4.33%)是未經(jīng)酶預處理組的1.5倍。徐興堂等[45]分別采用半纖維素酶、纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶及混合酶對興安落葉松針葉預處理后提取其精油，研究表明混合酶組預處理長安落葉松針葉后精油得率最高，為1.70%，相比未經(jīng)酶預處理組提高了38.20%。

對于天然產(chǎn)物中的非揮發(fā)性成分，傳統(tǒng)的溶劑提取法普遍存在耗時長、提取效率低的缺點。為了提高提取效率，生物酶預處理技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于天然產(chǎn)物中的非揮發(fā)性成分的提取。李佳妮等[46]將酶解輔助超聲波提取法應用于藜麥多糖的提取，研究表明：纖維素酶能夠酶解藜麥細胞壁，超聲波的空化作用進一步促進細胞破碎，最終促使多糖的提取率(68.08%)比單一采用超聲波提取增加1.5倍。孟永海等[47]使用果膠酶預處理白術(shù)藥材后再進行超聲波提取，使白術(shù)總黃酮提取得率(3.485 mg/g)是無酶預處理的1.7倍。穆易君等[48]用纖維素酶預處理菠菜后再進行超聲波提取，研究表明：該方法對菠菜中總黃酮的提取得率(15.56%)比超聲波輔助提取的得率高出2.51%。楊紅艷等[49]用果膠酶酶解預處理加超聲波促進提取的方法從黃連中提取鹽酸小檗堿，提取率為96.30%，與傳統(tǒng)提取方法相比，有效提高了鹽酸小檗堿的提取率，節(jié)約了提取時間。生物酶預處理技術(shù)在醇、酯、黃酮等多類天然產(chǎn)物的提取中都有應用，具體見表1(按提取物化學成分分類)。同時，該技術(shù)與多種提取手段結(jié)合后都有助于提取率的提高。

表1 生物酶預處理技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應用Table 1 Application of biological enzyme pretreatment technology in natural product extraction

續(xù)表1

綜上所述，生物酶輔助技術(shù)的主要優(yōu)勢為：1)生物酶輔助技術(shù)促進后續(xù)提取過程中提取效率的提高，對比直接提取，可以極大地縮短提取時間；2)生物酶預處理過程條件溫和、不存在或極少存在逆反應；3)生物酶用量可以準確控制，并且反應過程專一性強，因此可以有序地控制整個預處理過程；4)商業(yè)化生產(chǎn)的生物酶種類明確，作用機制清晰，可根據(jù)實際需求進行篩選、組合。

生物酶輔助技術(shù)相較于發(fā)酵技術(shù)，能夠?qū)I(yè)、科學地控制生物酶用量，避免了菌株被抑制生長的問題，彌補了微生物發(fā)酵技術(shù)的不足。但是，目前已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的生物酶種類有限，因此生物酶輔助技術(shù)不能完全取代發(fā)酵技術(shù)。

3 展 望

近幾年天然產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、日用品等方面的應用越來越受認可。天然產(chǎn)物的提取分離是天然產(chǎn)物開發(fā)利用的前提，也是保證天然產(chǎn)物得率和品質(zhì)的關(guān)鍵步驟。隨著多學科的相互滲透和交叉，生物技術(shù)研究與天然產(chǎn)物研究的結(jié)合日益密切，微生物發(fā)酵技術(shù)和酶輔助技術(shù)已經(jīng)開始作為生物預處理手段，應用于天然產(chǎn)物的提取分離。生物預處理技術(shù)能影響到天然產(chǎn)物利用率、化學成分和生物活性。目前存在的問題在于缺少先進的技術(shù)支持與規(guī)范的操作標準，這也是生物預處理重點研究和發(fā)展的方向。隨著天然產(chǎn)物應用范圍的不斷擴大，天然產(chǎn)物開發(fā)的產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，生物預處理技術(shù)在肉桂、油樟等大宗植物資源及其產(chǎn)物研究中將占有越來越重要的地位。