冉麗娟，曾珍，黎昌權(quán)

（重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 萬(wàn)州 404000）

芪歸益母膏是重慶市萬(wàn)州區(qū)中醫(yī)院在多年臨床治療、應(yīng)用過(guò)程中總結(jié)研發(fā)的自制制劑，處方由黃芪、當(dāng)歸、益母草、白芍等四味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)止痛的作用，臨床上用于月經(jīng)不調(diào)及痛經(jīng)等，臨床應(yīng)用效果滿意。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有通則檢查和薄層色譜鑒別試驗(yàn)，白芍在該制劑中為臣藥，其指標(biāo)成分明確，《中國(guó)藥典》2015年版一部［1］將芍藥苷作為白芍定量分析的指標(biāo)之一。本文采用高效液相色譜法對(duì)芪歸益母膏中白芍所含活性成分芍藥苷的含量進(jìn)行了方法學(xué)研究，為該制劑的質(zhì)量控制提供了定量檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，LCsolution色譜工作站。Sartorius型號(hào)為CP224S電子天平 （Max 210 g；d＝0.1 mg）、Sartorius型號(hào)為ME215S電子天平 （Max 210 g；d＝0.01 mg），分液漏斗，0.45μm微孔濾膜。

芍藥苷對(duì)照品 （購(gòu)買自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-201842，含量以97.4%計(jì)，使用前無(wú)需處理，供含量測(cè)定用），芪歸益母膏 （重慶市萬(wàn)州區(qū)中醫(yī)院提供，批號(hào)：20190605、20190829、20191029），正丁醇、乙醇、磷酸等均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［2-3］

色譜柱：InertSustainC18柱5μ（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸 （15∶85）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對(duì)照品14.19mg，置50mL量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理15min使溶解，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液3.00mL，置10mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品適量，混勻，精密稱取1.0g，置分液漏斗中，加水30mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30mL，合并正丁醇提取液，然后余液再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30mL。最后所得正丁醇液置蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，殘?jiān)酉∫掖?0mL溶解并定容至25mL量瓶中，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備

按處方 （不含白芍）及本品工藝制備供試品，按 “2.3”項(xiàng)方法處理即得陰性供試品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，色譜條件同上。記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1可得出，在此條件下，陰性供試品對(duì)芍藥苷的測(cè)定無(wú)干擾，而且芍藥苷和其他成分可達(dá)到基線分離，分離度R＞1.5。

圖1 芪歸益母膏HPLC圖譜

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密量取 “2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置10mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下，進(jìn)樣量為20μL進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積A與芍藥苷對(duì)照品的濃度C（mg／mL）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：A＝1.373×104C+2.037，r＝0.999 9。表明芍藥苷在0.0276～0.1382mg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，最后RSD為0.52%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次制得的供試品溶液20μL，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣1次，記錄色譜圖得到峰面積，芍藥苷峰面積的RSD為0.56%，保留時(shí)間基本不變。表明供試品溶液在24 h是穩(wěn)定的。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)供試品，制備6份供試品溶液，分別測(cè)定芍藥苷的含量，得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.027mg／g，RSD為0.85%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

稱取已得含量的供試品9份，每份1.0g，分別精密加 “2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液2、3、4mL（各3份），均按 “2.3”項(xiàng)下的方法處理，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝9）

2.11 供試品測(cè)定

分別取3批次供試品，按 “2.3”項(xiàng)下的方法制備得到3批供試品溶液，精密量取20μL，測(cè)定，每批同時(shí)測(cè)定3次，按外標(biāo)法計(jì)算芍藥苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 供試品含量測(cè)定結(jié)果 （n＝3）

3 討論

1）波長(zhǎng)的選擇，取供試品液用紫外檢測(cè)器，在200～400nm掃描，結(jié)果在230nm波長(zhǎng)處，芍藥苷的吸光度最大，故選用230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2）流動(dòng)相的選擇［2-3］，用不同比例的乙腈-0.05mol／L磷酸氫二鉀溶液和不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸 （15∶85）為流動(dòng)相時(shí)，芍藥苷峰形對(duì)稱，分離完全，陰性供試品無(wú)干擾，且理論板數(shù)高，拖尾因子小，故作為該試驗(yàn)流動(dòng)相。

3）在芪歸益母膏現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅有通則檢查和鑒別試驗(yàn)。據(jù)了解芪歸益母膏在該院卻廣泛用于臨床，療效明確，為有效地控制藥品質(zhì)量，建議增加芪歸益母膏的定量檢測(cè)。

4）采用HPLC測(cè)定芪歸益母膏中芍藥苷的含量，受主客觀因素的干擾較小，且準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可作為芪歸益母膏的定量分析方法。