曾靜，趙興玲，柳靜，劉士清，吳凱，王昌梅，楊紅，尹芳，張無敵

（云南師范大學(xué) 能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500）

有機(jī)垃圾，是指生活垃圾中含有有機(jī)物成分的廢棄物。從2017年3月開始，隨著 《生活垃圾分類制度實(shí)施方案》的發(fā)布，垃圾分類開始在全國各地進(jìn)行推廣。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約80%～90%的城市將有機(jī)垃圾納入分類類別［1］。由于其數(shù)量不斷增加，對有機(jī)垃圾的處理也顯得尤為重要。有機(jī)垃圾底物中富含碳水化合物，相關(guān)報(bào)道碳水化合物是發(fā)酵生物制氫的較優(yōu)底物［2］。因此，通過發(fā)酵生物制氫技術(shù)處理有機(jī)垃圾不僅實(shí)現(xiàn)了污染物的處理，同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了氫源的回收［3］。

目前，許多學(xué)者對有機(jī)垃圾進(jìn)行了大量研究。王勇等［4］學(xué)者研究了初始pH和溫度對餐廚垃圾厭氧發(fā)酵制氫的影響；賈璇等［5］學(xué)者在濕熱預(yù)處理對餐廚垃圾生物制氫潛力的影響方面進(jìn)行了研究；高?；艿龋?］學(xué)者研究了餐廚垃圾厭氧干發(fā)酵的產(chǎn)氫特性?？梢园l(fā)現(xiàn)，在垃圾發(fā)酵產(chǎn)氫的影響因素、厭氧消化方式、預(yù)處理等方向已做了相關(guān)研究。但是，針對有機(jī)垃圾發(fā)酵制氫過程中氫化酶的影響因素的探究鮮有報(bào)道。

發(fā)酵制氫是在氫酶的催化作用下，有機(jī)物被產(chǎn)氫微生物利用降解產(chǎn)生氫氣，同時(shí)生成揮發(fā)性脂肪酸 （VFA）、乙醇等代謝產(chǎn)物的過程［7］。氫酶也稱為氫化酶，是一類存在于微生物體內(nèi)的生物酶，它能可逆催化氫氣的氧化還原反應(yīng)［8］。氫化酶是能量代謝過程中氫釋放的最后限速酶系，在產(chǎn)氫代謝過程中發(fā)揮著重要作用［9］。根據(jù)氫化酶的催化功能可分為三類［10］：產(chǎn)氫氫化酶、耗氫氫化酶、雙向性氫化酶，其中產(chǎn)氫氫化酶能夠表征產(chǎn)氫系統(tǒng)中的產(chǎn)氫能效［11］。在微生物代謝產(chǎn)氫的過程中，影響氫化酶活性的影響因子有很多，如溫度、pH、m（C）／m（N）、金屬離子、底物濃度等。

本研究通過設(shè)置不同發(fā)酵料液含量的有機(jī)垃圾進(jìn)行發(fā)酵制氫，得出制氫過程中的產(chǎn)氫潛力，并對整個(gè)過程產(chǎn)氫量和氫化酶活性之間的變化關(guān)系以及氫化酶的影響因素進(jìn)行了探究。得出不同濃度有機(jī)垃圾產(chǎn)氫過程中氫化酶的影響因素，為后期控制多因素對氫化酶的影響從而提高有機(jī)垃圾產(chǎn)氫效率的研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)原料來源于云南師范大學(xué)能環(huán)學(xué)院辦公室內(nèi)日常丟棄的有機(jī)垃圾。為保證每批次原料組成成分相同，有機(jī)垃圾按m（果皮）∶m（剩飯）∶m（廢棄菜葉）∶m（茶渣） ＝1∶1∶1∶1進(jìn)行配比。其相關(guān)理化性質(zhì)如表1所示。接種物是在取部分實(shí)驗(yàn)室長期馴化的接種物的基礎(chǔ)上，再加入少量有機(jī)垃圾和豬糞作為營養(yǎng)物，在35±1℃下恒溫馴化，從而達(dá)到使用要求。經(jīng)測定，接種物TS為12.87%，VS為59.78%，pH為7。

表1 有機(jī)垃圾的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of kitchen waste

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

采用自行設(shè)計(jì)的批量式反應(yīng)裝置，由500mL的厭氧發(fā)酵瓶、排水瓶和集氣瓶和溫控系統(tǒng)組成。厭氧發(fā)酵瓶作為反應(yīng)容器，其有效容積為400mL，整個(gè)過程通過恒溫磁力攪拌水浴鍋控制厭氧反應(yīng)溫度，保持在35±1℃。裝置示意圖如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig 1 Schematic diagram of the experimental device

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定溫度為35±1℃，其中設(shè)置了三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)空白組，每組均重復(fù)設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，具體發(fā)酵料液的配制如表2。

表2 發(fā)酵料液配比Table 2 Ratio of fermentation liquid

1.4 測定方法

通過每天測量排水量記錄每個(gè)處理的沼氣產(chǎn)量［12］。采用福立GC9790II型氣相色譜儀測定各處的氫氣濃度，甲烷濃度和揮發(fā)性脂肪酸含量［13］。pH值、TS和VS是根據(jù)實(shí)驗(yàn)室以往所采用的方法測量的［14］。粗纖維采用國家標(biāo)準(zhǔn) （GB6434-86）所描述方法進(jìn)行測定。粗蛋白采用凱式定氮法［15］進(jìn)行測定。m（C）／m（N）中C利用TOC-2000儀進(jìn)行測定，N用凱式定氮法進(jìn)行測定。

產(chǎn)氫氫化酶活性的測定：首先在酶試劑盒中加入待測樣品10μL和甲基紫精試劑40μL混勻，封板后37℃反應(yīng)30min。洗滌液洗板5次加入HRP酶標(biāo)試劑50μL，封板后37℃反應(yīng)30min。再洗板5次加入TMB顯色劑和酸顯色劑37℃顯色10min。最后加入終止液終止反應(yīng)，顏色的深淺和樣品中的氫化酶呈正相關(guān)。15min內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度 （OD值）。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度的有機(jī)垃圾的制氫潛力

從實(shí)驗(yàn)發(fā)酵開始，每隔12h記錄一次產(chǎn)氣量和測定其沼氣中的氫氣含量，整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行繪制，如圖2所示。

圖2 不同濃度有機(jī)垃圾氫氣變化圖Fig 2 Changes of hydrogen in kitchen waste at different concentrations

圖2（a）為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組過程中單位產(chǎn)氫量及氫氣含量變化圖，圖2（b）為累積產(chǎn)氫量圖。從圖2（a）發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組氫氣含量的整體變化均呈現(xiàn)出先上升后下降再上升最后下降的趨勢，且每個(gè)實(shí)驗(yàn)組都出現(xiàn)了兩個(gè)峰值。有機(jī)垃圾中的有機(jī)質(zhì)主要包括碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等，碳水化合物相對于蛋白質(zhì)和脂肪更容易被微生物利用，因此在整個(gè)反應(yīng)過程中碳水化合物會(huì)優(yōu)先被利用［16］。伴隨著原料內(nèi)的大量碳水化合物被利用，8%和10%實(shí)驗(yàn)組在第24h出現(xiàn)第一個(gè)峰值，此時(shí)為氫氣含量最大值，分別為46%、50%。由于原料增多，水解速度相對較緩，12%實(shí)驗(yàn)組在第36h出現(xiàn)第一個(gè)峰值，也為最大峰值，為49%。隨著碳水化合物的消耗，此時(shí)微生物開始利用原料內(nèi)的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)制氫，8%、10%、12%實(shí)驗(yàn)組分別在第60h、72h、72h出現(xiàn)第二個(gè)氫含量峰值，此后氫含量開始下降，但始終保持在30%左右。單位產(chǎn)氫量呈現(xiàn)出現(xiàn)上升后下降的趨勢，所有實(shí)驗(yàn)組單位產(chǎn)氫量的峰值與氫氣含量峰值出現(xiàn)的時(shí)間一致，說明此時(shí)體系內(nèi)產(chǎn)氫微生物處于最佳活躍狀態(tài)，不斷利用有機(jī)質(zhì)進(jìn)行代謝產(chǎn)氫。此后單位產(chǎn)氫量開始下降趨于平緩，直至產(chǎn)氫結(jié)束。從圖2（b）看出，8%和10%實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵共進(jìn)行了96h，12%進(jìn)行了108h。8%和10%實(shí)驗(yàn)組在發(fā)酵前72h累積產(chǎn)氫量顯著增加，12%實(shí)驗(yàn)組在前84h累積產(chǎn)氫量顯著提高，均占總累積產(chǎn)氫量的95%以上。隨后，各實(shí)驗(yàn)組累積產(chǎn)氫量增長緩慢直至結(jié)束。其中，8%實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氫率為154mL／g，10%實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氫率為139mL／g，12%實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氫率為132mL／g?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著原料添加量的增加，產(chǎn)氫率逐漸降低，發(fā)酵時(shí)間相應(yīng)有所增加。

修正的Gompertz方程可以用來描述厭氧發(fā)酵過程中的產(chǎn)氫情況［17］，方程如 （1）：

式中：y（t）表示時(shí)間t時(shí)的累積產(chǎn)氫量 （mL），當(dāng)t→∞時(shí)，y（t）→a，有Hm＝a為最大累積產(chǎn)氫量 （mL）；Rm＝a·c/e為最大產(chǎn)氫速率 （mL／h）；λ＝（b-1）/c，λ為發(fā)酵滯留時(shí)間 （h）。e為exp（1）＝2.71828。實(shí)際數(shù)據(jù)處理過程中，利用origin軟件對參數(shù)a、b、c進(jìn)行擬合，然后轉(zhuǎn)換為Hm、Rm、λ的值，如表3。

表3 有機(jī)垃圾發(fā)酵制氫的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table3 Kinetic parameters of hydrogen production from kitchen waste fermentation

由表可知，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過方程擬合后的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，說明修正的Gompertz方程能很好的描述有機(jī)垃圾發(fā)酵制氫過程中的產(chǎn)氣情況。各實(shí)驗(yàn)組的累積產(chǎn)氫量和TS產(chǎn)氫率與實(shí)際值基本接 近，TS產(chǎn) 氫 率 分 別 為154mL／g、137mL／g、132mL／g，8%實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氫率高于其余兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。最大產(chǎn)氫速率分別為39mL／h、65mL／h、84mL／h，12%實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氫速率最快?？梢园l(fā)現(xiàn)，濃度越高的實(shí)驗(yàn)組雖然產(chǎn)氫速率更快但是其TS產(chǎn)氫率卻較低，可能出現(xiàn)的原因是原料添加量的增加，微生物在水解酸化階段反應(yīng)相對較緩，導(dǎo)致體系內(nèi)酸物質(zhì)的積累從而影響產(chǎn)氣。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵滯留時(shí)間相差不大并且時(shí)間都較短，說明利用垃圾作為原料發(fā)酵制氫能較快的啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)。

2.2 有機(jī)垃圾發(fā)酵制氫發(fā)酵類型

液相末端發(fā)酵產(chǎn)物在厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫過程中能夠反映系統(tǒng)內(nèi)的代謝特征和微生物群落結(jié)構(gòu)變化，不同的液相末端發(fā)酵產(chǎn)物組成也代表著系統(tǒng)內(nèi)不同的發(fā)酵類型［18］。圖3表示了不同發(fā)酵濃度發(fā)酵過程中VFAs的變化，觀察到所有實(shí)驗(yàn)組在開始發(fā)酵前系統(tǒng)內(nèi)液相產(chǎn)物主要以乙酸為主，含量均高達(dá)80%以上，并含有少量其他脂肪酸。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各實(shí)驗(yàn)組的揮發(fā)性脂肪酸含量均發(fā)生了變化。其中，所有實(shí)驗(yàn)組結(jié)束后系統(tǒng)內(nèi)液相末端產(chǎn)物主要由乙酸和丁酸居多，二者之和高達(dá)96%以上。因此，有機(jī)垃圾為原料的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫類型為丁酸型發(fā)酵。宋佳秀等［20］認(rèn)為丁酸型發(fā)酵是產(chǎn)氫最有效的發(fā)酵類型之一。在實(shí)驗(yàn)過程中除乙酸、丁酸外，還伴隨著少量的丙酸、戊酸、異丁酸等末端液相產(chǎn)物生成。發(fā)酵結(jié)束后8%實(shí)驗(yàn)組中丁酸占比較發(fā)酵前增加了32%，10%實(shí)驗(yàn)組中丁酸占比較發(fā)酵前增加了52%，12%實(shí)驗(yàn)組中丁酸占比較發(fā)酵前增加了50%。結(jié)合圖3中氫氣含量變化發(fā)現(xiàn)，丁酸占比增加得多，相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組氫氣含量峰值越高，丁酸的產(chǎn)生一定程度上可以調(diào)節(jié)由于乙酸積累產(chǎn)生的NADH+H+和NAD+之間的一種生理上的平衡，從而促進(jìn)產(chǎn)氫細(xì)菌的作用［21］。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組中VFA各組分隨時(shí)間的變化Fig 3 Changes of VFA components in each experimental group over time

2.3 產(chǎn)氫量與氫化酶活性之間的變化

在發(fā)酵制氫的能量代謝過程中，氫化酶作為氫釋放的最后限速酶系，產(chǎn)氫細(xì)菌的能量代謝直接受其活性的高低以及表達(dá)周期的長短影響，并且其活性和表達(dá)周期也會(huì)間接影響到氫氣的釋放速度和產(chǎn)量［22］。從圖4看出，各實(shí)驗(yàn)組氫化酶活性與產(chǎn)氫量均呈現(xiàn)出一致的先上升后下降的趨勢。在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，實(shí)驗(yàn)前72h左右產(chǎn)氫細(xì)菌活躍，具有很強(qiáng)的產(chǎn)氫活性，此時(shí)產(chǎn)氫速率也較高，隨后細(xì)菌活性逐漸降低，產(chǎn)氫速率也隨之下降，直至細(xì)菌衰亡產(chǎn)氫停止。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第24h，8%和10%實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氫氫化酶活性均出現(xiàn)最大值，此時(shí)產(chǎn)氫速率也最快，分別為43mL／h和81mL／h，這個(gè)時(shí)候兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的產(chǎn)氫氫化酶均處于最活躍狀態(tài)，能夠快速進(jìn)行代謝產(chǎn)氫。在12%實(shí)驗(yàn)組中，實(shí)驗(yàn)到達(dá)第36h時(shí)，產(chǎn)氫速率出現(xiàn)峰值為86mL／h，然而此時(shí)產(chǎn)氫氫化酶活性沒有出現(xiàn)最大值，而是在第48h出現(xiàn)峰值，可能是因?yàn)樵诘?6h時(shí)如脫氫酶系等其他與產(chǎn)氫有關(guān)的酶系出現(xiàn)且較活躍，共同作用促進(jìn)氫氣的生成導(dǎo)致在此時(shí)出現(xiàn)了最快產(chǎn)氫速率。峰值過后，氫化酶活性衰弱，產(chǎn)氫量也快速下降，當(dāng)氫化酶基本失活時(shí)，產(chǎn)氫量趨于平緩至結(jié)束?？梢钥闯觯a(chǎn)氫氫化酶的活性一定程度上會(huì)影響產(chǎn)氫細(xì)菌的代謝和表達(dá)，并且有機(jī)垃圾發(fā)酵液濃度越高，其氫化酶酶活出現(xiàn)峰值的時(shí)間會(huì)往后有所推移。

圖4 氫化酶活性與產(chǎn)氫量隨時(shí)間的變化關(guān)系圖Fig 4 Relationship between hydrogenase activity and hydrogen production over time

2.4 pH與氫化酶活性的變化情況

在有機(jī)垃圾進(jìn)行水解酸化的過程中，由于大量有機(jī)酸的積累，導(dǎo)致此時(shí)體系內(nèi)pH值不斷下降，影響產(chǎn)氫微生物細(xì)胞內(nèi)氫化酶的活性和代謝途徑等，從而影響產(chǎn)氫菌的產(chǎn)氫能力，當(dāng)pH值降低至一定程度時(shí)，將導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)氫過程的停止。從圖5得出，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別在前72h、72h、96h都由于有機(jī)酸的積累導(dǎo)致pH快速下降，當(dāng)pH下降至過低范圍時(shí)，會(huì)抑制體系內(nèi)微生物的作用，從而導(dǎo)致產(chǎn)氣趨于停止，與前面累積產(chǎn)氣量的變化趨勢一致。在pH下降過程中，各實(shí)驗(yàn)組氫化酶活性均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。8%實(shí)驗(yàn)組在pH下降至5.5時(shí)獲得氫化酶酶活最大值，10%實(shí)驗(yàn)組也是在pH為5.5時(shí)獲得了氫化酶酶活最大值，12%實(shí)驗(yàn)組在pH為5.0時(shí)獲得了氫化酶酶活的最大值，當(dāng)pH下降緩慢趨于穩(wěn)定時(shí)，此時(shí)酶活也隨之喪失?？梢园l(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH在5～5.5范圍內(nèi)時(shí)，氫化酶活性相對較強(qiáng)，能夠很好的促進(jìn)產(chǎn)氫細(xì)菌的作用，并且，pH過高或過低不僅會(huì)影響氫化酶的酶活，降低其產(chǎn)氫能力還會(huì)影響整個(gè)發(fā)酵過程的產(chǎn)氣情況。因此，在利用有機(jī)質(zhì)制氫的過程中，控制其pH范圍極為重要。

圖5 各實(shí)驗(yàn)組氫化酶與pH隨時(shí)間的變化Fig 5 Changes of hydrogenase and pH in each experimental group over time

2.5 m（C）／m（N）與氫化酶活性的變化情況

在微生物的生長和代謝過程中，C和N這兩種營養(yǎng)元素起著不可或缺的作用。m（C）／m（N）作為發(fā)酵制氫的一個(gè)重要參數(shù)，能影響有機(jī)物在微生物體內(nèi)的生物氧化過程和通過微生物自身的合成代謝過程進(jìn)一步導(dǎo)致厭氧微生物細(xì)胞內(nèi)的NADH+H+／NAD+比率和發(fā)酵產(chǎn)物數(shù)量變化［23］。代謝產(chǎn)物積累、微生物生長、代謝途徑以及酶活性水平等都受m（C）／m（N）的影響。其通過影響氫化酶活性的表達(dá)，從而影響產(chǎn)氫能力。m（C）／m（N）與氫化酶活性的變化情況見圖6。

圖6 各實(shí)驗(yàn)組氫化酶與m（C）／m（N）隨時(shí)間的變化Fig 6 Changes of hydrogenase and m（C）／m（N）over time in each experimental group

從圖6看出，在8%實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)m（C）／m（N）值為20時(shí)，氫化酶活性最強(qiáng)，10%實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)m（C）／m（N）值為23時(shí)，獲得氫活酶活性最大值，12%實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)m（C）／m（N）值為21時(shí)，獲得氫化酶活性最大值。所以，當(dāng)m（C）／m（N）范圍在20～25左右時(shí)，氫化酶活性相對較強(qiáng)，產(chǎn)氫細(xì)菌可以更好的被利用進(jìn)行代謝制氫。張璐［24］在探究m（C）／m（N）對YUAN-3產(chǎn)氫能力及氫化酶活性的影響實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，隨著m（C）／m（N）比的提高，YUAN-3的氫化酶活性不斷加大，當(dāng)m（C）／m（N）比為22.4時(shí)，YUAN-3獲得最大氫化酶活性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)論與其一致。

3 結(jié)論

1）探究8%、10%、12%三個(gè)不同的生活垃圾發(fā)酵制氫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氫潛力分別為154mL／g、139mL／g、132mL／g，最大產(chǎn)氫速率分別為43mL／h、81mL／h、86mL／h。結(jié)合產(chǎn)氫潛力、最大產(chǎn)氫速率、發(fā)酵時(shí)間考慮，當(dāng)發(fā)酵濃度為8%時(shí)，制氫效果最好。產(chǎn)氫過程中液相末端產(chǎn)物主要為乙酸和丁酸，兩者之和占比高達(dá)90%以上，發(fā)酵類型為典型的丁酸型發(fā)酵。

2）氫化酶活性與產(chǎn)氫量有著密切的相關(guān)性，當(dāng)氫化酶活性達(dá)到最大值時(shí)，產(chǎn)氫速率基本趨于最快。發(fā)酵液濃度越高時(shí)，其氫化酶酶活出現(xiàn)峰值的時(shí)間會(huì)往后有所推移。

3）有機(jī)垃圾發(fā)酵制氫過程中，單獨(dú)分析了pH和m（C）／m（N）分別對氫化酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH在5～5.5范圍內(nèi)、m（C）／m（N）在20～25范圍內(nèi)時(shí)，氫化酶活性相對較強(qiáng)，能夠很好的促進(jìn)產(chǎn)氫細(xì)菌的作用，進(jìn)行代謝產(chǎn)氫。為后續(xù)研究多因素共同作用對氫化酶活性的影響提供了參考。