李華峰 張廣鳳 趙文杰 李敏 田霖林 鞠文文

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，黑龍江 齊齊哈爾 161002)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，若早期治療不及時，可導(dǎo)致腎臟功能嚴(yán)重?fù)p傷而威脅患者生命。DN的發(fā)病機制十分復(fù)雜，相關(guān)研究表明，氧化應(yīng)激及高血糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡在DN發(fā)病及進展中都起到重要作用〔1～3〕。microRNA(miR)是一類小分子非編碼RNA，近年來對DN患者血清、尿液中miR表達(dá)水平的研究表明，miR異常表達(dá)與DN病理生理過程密切相關(guān)，且證實利用miR干擾靶基因轉(zhuǎn)錄后翻譯的特性，對DN起到治療改善作用〔4～6〕。Federica等〔7〕報道，miR-424在早期DN患者尿液外泌體中表達(dá)下調(diào)，可能參與DN病理過程。胰島素樣生長因子(IGF)-1是一類多功能細(xì)胞調(diào)控因子，有研究報道，高糖培養(yǎng)可增加人腎小球細(xì)胞中IGF-1釋放，誘導(dǎo)IGF-1受體(IGF1R)表達(dá)上調(diào)而加重腎小球損傷〔8〕。此外，IGF1R拮抗劑可通過抑制腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化改善DN大鼠腎纖維化，提示抑制IGF1R具有改善腎損傷的作用〔9〕。目前，miR-424和IGF1R對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響未見報道。本研究以大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1為研究對象，探討miR-424和IGF1R在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1購自上海富衡生物科技有限公司。

1.2主要試劑 胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；miR陰性對照、miR-424-mimics、小干擾RNA陰性對照、siRNA-IGF1R、pcDNA3.1空載體、pcDNA3、1-IGF1R均于廣州輝駿生物科技有限公司合成；實驗用一抗和二抗購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA比色法)，超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT核黃素比色法)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(微量酶標(biāo)法)購自碧云天生物技術(shù)研究所；實驗用其他生化試劑均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組 預(yù)先配制含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。將冷凍的HBZY-1細(xì)胞迅速放入37℃水浴鍋中解凍，1 000 r/min離心1 min，棄上清，加入1 ml培養(yǎng)液重懸，取適量細(xì)胞懸液加入盛有5 ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至90%左右融合時，加入0.25%胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng)。

將對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機分組：正常糖濃度組(NG組，培養(yǎng)液中糖濃度5.5 mmol/L)、高糖組(HG組，培養(yǎng)液中糖濃度25.0 mmol/L)、高糖+轉(zhuǎn)染組〔細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR陰性對照(miR-con)、miR-424-mimics(miR-424)、小干擾RNA陰性對照(si-con)、siRNA-IGF1R(si-IGF1R)、pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-IGF1R(pcDNA-IGF1R)后，在糖濃度25.0 mmol/L的培養(yǎng)液中培養(yǎng)〕。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞和上清液進行后續(xù)實驗。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)實驗 用TRIzol試劑抽提細(xì)胞RNA，紫外分光光度計下檢測RNA樣品純度，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品完整性。使用Takara逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，以cDNA為模板采用SYBR Green染料法進行qPCR反應(yīng)。結(jié)果采用2-△△Ct法，以U6為內(nèi)參基因計算miR-424相對表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參基因計算IGF1R mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.3Western印跡實驗 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法檢測蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用5%脫脂奶粉呢封膜2 h。TBST溶液洗膜，加入IGF1R抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和β-actin抗體一抗4℃ 孵育過夜，TBST溶液洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。洗膜后加入ECL發(fā)光液中顯色。凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析蛋白灰度值，計算目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.3.4細(xì)胞上清液中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 采用比色法檢測細(xì)胞上清液中MDA和SOD含量，采用酶標(biāo)法檢測上清液中LDH活性，實驗操作方法嚴(yán)格參照試劑盒說明書進行。

1.3.5雙染法流式細(xì)胞術(shù) 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個/ml并轉(zhuǎn)移至無菌離心管，離心，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液洗滌細(xì)胞2次。用1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后分別加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)各5 μl混勻，避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.6雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?收集對數(shù)生長期的HBZY-1細(xì)胞，將IGF1R-3′UTR野生型(WT)質(zhì)粒和IGF1R-3′UTR突變型(MUT)質(zhì)粒，分別與miR-con、miR-424-mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，加入裂解液裂解，4℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清液檢測熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-424和IGF1R在高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá) 與NG組比較，HG組大鼠腎小球系膜細(xì)胞中miR-424表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，IGF1R mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 腎小球系膜細(xì)胞IGF1R蛋白表達(dá)

表1 腎小球系膜細(xì)胞中miR-424和IGF1R的表達(dá)

2.2上調(diào)miR-424抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡 與NG組比較，HG組大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與HG+miR-con組比較，HG+miR-424組腎小球系膜細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表2和圖2、圖3。

圖3 Western印跡檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

表2 miR-424過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響

2.3上調(diào)miR-424抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷 與NG組比較，HG組腎小球系膜細(xì)胞中LDH、MDA活性明顯增強(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)；與HG+miR-con組比較，HG+miR-424組腎小球系膜細(xì)胞中LDH、MDA活性明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯增強(P<0.05)。見表3。

表3 miR-424過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響

2.4miR-424靶向調(diào)控IGF1R的表達(dá) 生物信息學(xué)軟件TargetScan分析結(jié)果miR-424能夠與IGF1R的3′UTR區(qū)靶向結(jié)合(圖4A)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果(表4)，過表達(dá)miR-424明顯抑制腎小球系膜細(xì)胞中IGF1R轉(zhuǎn)錄活性，而將IGF1R的3′UTR區(qū)突變后抑制作用消失。Western印跡結(jié)果表明(圖4B)，與miR-con組(0.31±0.04)比較，miR-424細(xì)胞中IGF1R蛋白表達(dá)明顯減少(0.09±0.03，P<0.05)；與anti-miR-con組(0.27±0.03)比較，anti-miR-424組細(xì)胞中IGF1R蛋白表達(dá)明顯減少增多(0.69±0.08，P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖4 miR-424靶向調(diào)控IGF1R的表達(dá)

2.5沉默IGF1R抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡和細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷 與HG+si-con組比較，HG+si-IGF1R組腎小球系膜細(xì)胞中IGF1R蛋白和Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞中LDH和MDA活性明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯增強(P<0.05)。見表5和圖5。

表5 沉默IGF1R對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響

圖5 腎小球系膜細(xì)胞中IGF1R、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.6過表達(dá)IGF1R逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-424對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的保護作用 與HG+miR-424+pcDNA組比較，HG+miR-424+pcDNA-IGF1R組腎小球系膜細(xì)胞中IGF1R蛋白和Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞中LDH和MDA活性明顯增強(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)。見表6和圖6。

表6 過表達(dá)IGF1R和上調(diào)miR-424對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的影響

圖6 腎小球系膜細(xì)胞中IGF1R、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討 論

系膜細(xì)胞作為腎小球固有細(xì)胞中最為活躍的細(xì)胞，其凋亡異常改變在腎小球損傷過程中起關(guān)鍵作用，對慢性腎臟疾病具有重要研究意義〔10，11〕。Bcl-2蛋白家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白因子，其中Bax是Bcl-2家族中最具有代表性的促凋亡蛋白，而Bcl-2是Bcl-2家族中最具有代表性的抗凋亡蛋白〔12〕。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax異常高表達(dá)時，細(xì)胞凋亡率增加，Bax低表達(dá)或不表達(dá)時細(xì)胞凋亡率降低，而Bcl-2則相反〔13〕。本研究結(jié)果說明高糖可誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡增加。

正常生理狀態(tài)下，機體可產(chǎn)生少量活性氧參與正常代謝；而高糖可誘導(dǎo)腎組織細(xì)胞內(nèi)活性氧大量產(chǎn)生，使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA過量產(chǎn)生，超過腎臟內(nèi)源性抗氧化物對其清除能力，從而導(dǎo)致腎臟發(fā)生氧化應(yīng)激損傷〔14，15〕。LDH異常增高與組織器官受損程度呈正比，與MDA一起是氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物〔16〕。本研究說明細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷。miR-424是一種重要的miRNA，Wang等〔17〕報道，miR-424在DN大鼠腎組織中表達(dá)顯著下調(diào)，而干擾miR-424可有效改善大鼠腎臟病變程度和癥狀。本研究結(jié)果說明過表達(dá)miR-424對高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞損傷有保護作用。

IGF是影響腎臟細(xì)胞病理生理功能的重要因子。陳海燕等〔18〕報道，DN患者血清IGF-1水平顯著升高，與2型DN發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)。IGF1R是IGF-1的特異性受體，本研究結(jié)果，IGF-1能夠促進腎小球系膜細(xì)胞增生和系膜外基質(zhì)發(fā)生擴張，導(dǎo)致腎小球硬化，還可增加腎小球系膜細(xì)胞對葡萄糖的攝取，其促進DN發(fā)生及發(fā)展的作用依賴于腎臟細(xì)胞中特異性受體IGF1R的存在〔19，20〕。因此抑制IGF1R表達(dá)可阻斷IGF-1對腎小球的損傷，減輕高糖刺激的腎臟損傷。

本研究通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，IGF1R可能是miR-424的靶基因。相關(guān)實驗證實在大鼠腎小球系膜細(xì)胞中miR-424可靶向負(fù)調(diào)控IGF1R的表達(dá)，進一步分析發(fā)現(xiàn)，與單獨過表達(dá)miR-424的細(xì)胞相比，同時過表達(dá)miR-424和IGF1R的細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡率增加，氧化應(yīng)激水平升高，推測miR-424通過靶向IGF1R發(fā)揮對高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的改善作用，保護腎臟組織。

綜上，高糖條件下，大鼠腎小球系膜細(xì)胞中miR-424表達(dá)降低，IGF1R表達(dá)升高，與高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激水平有關(guān)。干擾miR-424可能通過靶向IGF1R降低高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，降低腎臟細(xì)胞損傷程度，為miR-424在DN靶向治療中的應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。