莫安薇 黃琰菁 楊生輝 王燕艷

(海南省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科二區(qū)，海南 海口 570311)

克羅恩病(CD)是炎癥性腸病(IBD)的一種，該病以慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥為主要臨床表現(xiàn)〔1〕。CD患者的病理學(xué)改變主要為透壁性腸炎，而這種炎癥的典型特點是過度激活的Th1及Th17型免疫反應(yīng)，相反Treg水平顯著低下〔2〕。此外，腸屏障功能受損也是CD的主要發(fā)病機制假說之一。因此，針對腸黏膜免疫反應(yīng)和屏障保護的治療有望延緩CD疾病進程。槐果堿(Sophocarpine)是從中藥苦豆子植物中提取的一種生物堿，新近的研究顯示其具有抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用〔3,4〕。本文觀察Sophocarpine對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 采用6～8周齡，雄性Balb/c小鼠(購于南京大學(xué)模式動物研究所)，體重為(22.0±1.5)g，SPF環(huán)境飼養(yǎng)，控制環(huán)境溫度為(23±2)℃，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2主要試劑 Sophocarpine(貨號：SML2422)、TNBS(貨號：P2297)、異硫氰酸熒光素(FITC)-葡聚糖(貨號：46944)購于美國Sigma公司。兔抗鼠胱冬肽酶(Caspase)-1抗體(貨號：ab179515)、兔抗鼠凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)抗體(貨號：ab238848)、兔抗鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3(貨號：ab232401)、兔抗鼠ZO-1抗體(貨號：ab96587)及兔抗鼠claudin-1抗體(貨號：ab15098)均購于英國Abcam公司。白細胞介素(IL)-10(貨號：PM1000B)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(貨號：PMTA00B)及干擾素(IFN)-γ(貨號：PMIF00)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于美國R&D公司。

1.3結(jié)腸炎模型建立及分組干預(yù) Balb/c小鼠接受TNBS造模，采用0.7%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)肛門灌入0.1 ml TNBS 50%乙醇溶液(TNBS劑量為150 mg/kg)，保持小鼠頭低腳高傾斜30°體位30 min，7 d后小鼠形成穩(wěn)定的腸炎〔5〕。造模后隨機分為模型組及干預(yù)組，每組8只。干預(yù)組每日接受Sophocarpine腹腔注射(50 mg/kg，溶于0.1 ml生理鹽水)，模型組接受等量生理鹽水。干預(yù)4 w后處死小鼠進行后續(xù)檢測。

1.4結(jié)腸組織學(xué)炎癥評分 取小鼠結(jié)腸常規(guī)進行石蠟包埋，HE染色，參照Spencer等〔6〕報道進行炎癥評分，評分范圍0～4分，分數(shù)高提示炎癥嚴重。

1.5結(jié)腸黏膜炎癥介質(zhì)水平評估 刮取小鼠結(jié)腸黏膜組織，采用ELISA試劑盒，依據(jù)說明檢測TNF-α、IFN-γ及IL-10水平。

1.6腸通透性評估 依據(jù)既往報道〔7〕，禁食4 h后，灌胃法給予每只小鼠FITC-葡聚糖600 mg/kg；灌胃后4 h處死，眼球取血0.5 ml，靜置后分離提取血清，采用熒光測定法檢測FITC-葡聚糖水平。

1.7脾及腸系膜淋巴結(jié)Treg細胞檢測 取小鼠腸系膜淋巴結(jié)及脾臟，勻漿，用流式細胞檢測法檢測Treg(Foxp3+CD25+CD4+)細胞比例，采用FlowJo-V10軟件分析Treg細胞在脾和淋巴結(jié)中的比例。

1.8Western印跡法檢測小鼠結(jié)腸內(nèi)蛋白 刮取腸黏膜組織，充分勻漿，提取總蛋白，Bradford法定量，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入Caspase-1、ASC、NLRP3、ZO-1、claudin-1或β-actin一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃搖床12 h，滴加二抗，洗膜，顯影并拍照，結(jié)果采用Image J軟件分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad8.0軟件進行非配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Sophocarpine改善了結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織學(xué)炎癥評分 模型組結(jié)腸組織炎癥評分〔(3.10±0.74)分〕顯著高于干預(yù)組〔(2.10±0.74)分，P<0.01〕。見圖1。

圖1 兩組結(jié)腸組織炎癥(HE，×100)

2.2Sophocarpine抑制了結(jié)腸炎小鼠腸黏膜炎癥介質(zhì)水平 干預(yù)組結(jié)腸黏膜炎癥介質(zhì)IFN-γ〔(18.56±3.98)pg/mg〕及TNF-α水平〔(23.65±5.10)pg/ml〕顯著低于模型組〔(32.69±5.90)pg/ml、(39.53±6.92)pg/ml〕，而IL-10水平〔(31.53±4.87)pg/mg〕顯著高于模型組〔(23.65±5.19)pg/mg，P<0.01〕。

2.3Sophocarpine促進了結(jié)腸炎小鼠脾及腸系膜淋巴結(jié)Treg細胞比例 干預(yù)組脾及腸系膜淋巴結(jié)Treg細胞比例(7.53%±1.89%、8.95%±1.96%)均顯著高于模型組(4.23%±0.79%、5.19%±1.24%，P<0.01)。兩組1例樣本流式分析。見圖2。

圖2 兩組各1例樣本Treg細胞比例

2.4Sophocarpine干預(yù)改善了結(jié)腸炎小鼠腸屏障功能 干預(yù)組腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1(1.89±0.26)及claudin-1水平(2.16±0.31)均顯著高于模型組(1.00±0.18、1.00±0.16，P<0.01〕；腸屏障通透性實驗顯示，干預(yù)組血清FITC-葡聚糖濃度〔(369.51±89.69)ng/ml〕顯著低于模型組〔(852.96±125.30)ng/ml，P<0.01〕。見圖3。

圖3 兩組腸屏障功能檢測

2.5Sophocarpine干預(yù)抑制了結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸NLRP3炎性小體信號 干預(yù)組腸黏膜NLRP3(1.00±0.13)、ASC(1.00±0.12)及Caspase-1水平(1.00±0.14)均顯著低于模型組(1.68±0.21、2.16±0.36、2.35±0.38，P<0.01)。見圖4。

圖4 兩組腸黏膜NLRP3炎性小體

3 討 論

既往IBD屬于較為罕見的疾病，而近年來其發(fā)病率的迅速攀升已成為消化系統(tǒng)領(lǐng)域的一個棘手問題。我國的IBD診療水平尚處于起步與發(fā)展階段，仍然面臨諸多問題。導(dǎo)致IBD臨床治療效果不佳的最終因素是發(fā)病機制不明確，這使得拮抗結(jié)腸炎癥成為治療的關(guān)鍵點〔8〕。當前的治療藥物多以免疫抑制為主，雖然具有一定療效但卻有較多的毒副作用〔9〕。青蒿素在瘧疾治療中取得的巨大成功，啟發(fā)學(xué)術(shù)界從植物提取物中發(fā)掘有效的免疫調(diào)節(jié)劑用于治療IBD。Sophocarpine是一種生物堿，來源于天然植物，具有較高的生物安全性〔3〕。既往研究顯示Sophocarpine可以通過下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路從而改善小鼠關(guān)節(jié)炎〔10〕。也有研究顯示Sophocarpine可以通過抑制NLRP3炎癥小體而改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的腎炎〔10〕。事實上，CD和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有相似的免疫病理學(xué)改變，這些疾病的炎癥反應(yīng)均主要表現(xiàn)為Th1型免疫反應(yīng)亢進，而Treg細胞比例下降〔11〕。

IFN-γ及TNF-α是Th1、Th17細胞下游重要的促炎介質(zhì)，在維持IBD腸道慢性炎癥及引發(fā)炎癥級聯(lián)放大中發(fā)揮關(guān)鍵促進作用；而IL-10是機體為數(shù)不多的抗炎細胞因子，在平衡局部和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔12,13〕。本文結(jié)果提示Sophocarpine在體治療具有調(diào)節(jié)腸道局部炎癥反應(yīng)的效果。Treg是一種免疫調(diào)節(jié)細胞，可抑制過度激活的免疫/炎癥反應(yīng)，在IBD的免疫病理過程中發(fā)揮保護性作用；且Treg還具有調(diào)節(jié)腸道局部Th1、Th17免疫細胞平衡的作用，這一定程度解釋了Sophocarpine的抗炎作用途徑〔14,15〕。腸屏障功能的破壞導(dǎo)致IBD患者腸黏膜免疫系統(tǒng)直接與腸道內(nèi)抗原接觸，從而引發(fā)或維持急慢性腸道炎癥，這是經(jīng)典的IBD發(fā)病機制假說之一〔16〕。本研究顯示Sophocarpine治療可顯著改善結(jié)腸炎小鼠腸屏障結(jié)構(gòu)和功能，這可能是其拮抗腸炎的另一重要途徑〔17〕。NLRP3炎性小體在IBD患者腸道炎癥反應(yīng)中扮演重要促進角色，其下游調(diào)控IL-1β等多種促炎介質(zhì)表達，且其抑制Treg細胞〔18,19〕。本文結(jié)果提示，Sophocarpine可顯著抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織內(nèi)NLRP3炎癥小體的水平，這可能是其發(fā)揮保護腸道的作用機制之一。由此可見，Sophocarpine可通過影響腸道局部免疫細胞亞群平衡、抑制NLRP3及炎癥介質(zhì)水平發(fā)揮腸道炎癥保護性作用，但更深入的作用機制仍待明確。