崔健昆，耿乃志，孟凡吉，施麗春，田耕,楊桂青

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150081;3.煙臺(tái)中醫(yī)醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264000)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemic reperfusion in jury，MIRI) 指冠狀動(dòng)脈短暫阻塞后再通所造成心肌組織結(jié)構(gòu)損傷加重的病理過(guò)程。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，氧化應(yīng)激、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、鈣超載和細(xì)胞凋亡等機(jī)制均與MIRI關(guān)系密切。細(xì)胞自噬作為一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，在 MIRI的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，成為新的治療靶點(diǎn)[1-2]。mTOR屬于PI3K蛋白激酶類(lèi)家族中成員，是許多與自噬相關(guān)的信號(hào)通路交匯節(jié)點(diǎn)，而且與 MIRI有著密切的聯(lián)系[3]，其中PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路對(duì)自噬起重要的負(fù)調(diào)控作用。

去甲氧基姜黃素(Demethoxy Curcumin,DMC)是傳統(tǒng)中藥姜黃的主要活性成份，作為姜黃素的天然衍生物，二者具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和相似的藥理作用。姜黃素具有具有抗缺血、抗缺氧、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等多種藥理作用[4]，臨床廣泛用于心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、心律失常等疾病的治療[5-7]，但關(guān)于DMC對(duì)心血管疾病的作用和機(jī)制研究較少。本研究以大鼠心肌缺血再灌注模型為研究對(duì)象，以PI3K-Akt-mTOR 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討DMC通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及可能機(jī)制，為DMC臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(黑)2016004。大鼠在恒溫恒濕、明暗交替的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

1.2 藥品與主要試劑

去甲氧基姜黃素(DMC)，TTC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CK-MB、LDH、MDA和SOD檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程公司；IL-6、IL-1β、TNF-αELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司；抗體GAPDH、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、p62、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、mTOR、p-mTOR均購(gòu)自CST公司。RIPA裂解液、BCA試劑盒、BlueRanger預(yù)染蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自美國(guó) MBI公司。

1.3 主要儀器

BL-420F型生物信號(hào)采集系統(tǒng)，成都泰盟；DHX-300型小動(dòng)物呼吸機(jī)，成都儀器廠；Multiscan MK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；Olympus CX31正置顯微鏡，日本Olympus公司；2135型組織切片機(jī)，德國(guó)徠佧；164-5051型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀，Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 分組給藥和模型制備

SD大鼠經(jīng)心電圖篩選合格后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、DMC預(yù)處理10、15和30 mg/kg組，每組15只。將DMC用二甲亞砜(DMSO)溶解備用，再用生理鹽水稀釋至所需濃度，DMC預(yù)處理組大鼠腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)7 d；假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。末次給藥后大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉75 mg/kg麻醉后位固定，用標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測(cè)大鼠心電圖，并連接呼吸機(jī)。沿胸骨左緣鈍性分離肌肉，剪斷第4肋骨，暴露出心臟并打開(kāi)心包，用無(wú)創(chuàng)縫合線在左冠狀動(dòng)脈前降支起始段下2～3 mm 處結(jié)扎。以心電圖S-T段抬高 ≥0.1 mV 或T波高聳，心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功標(biāo)志，心肌缺血30 min后，打開(kāi)結(jié)扎線再灌注120 min。假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎外給予相同處理。

1.5 血清指標(biāo)檢測(cè)

再灌注120 min后靜脈取血靜置離心，取血清分裝后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按照試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)血清中CK-MB、LDH、MDA、SOD、IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.6 TTC法檢測(cè)大鼠心肌梗死面積

快速取出心臟放入4 ℃生理鹽水清洗心腔內(nèi)血液后，放入-20 ℃冰箱冷凍25 min。將心臟沿結(jié)扎線與房室溝平行方向橫切成5 片，每片厚約2 mm，1% TTC溶液(pH7.4)中37 ℃染色15 min，吸干水分后的放入10%甲醛溶液中固定。正常心肌染為紅色，梗死區(qū)心肌呈淡白色。拍照后用Image pro plus6.0圖像分析軟件計(jì)算心肌梗死面積，用缺血面積占左心室面積百分比來(lái)表示。

1.7 HE染色觀察心肌組織病理變化

取心肌組織10%甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗2 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟后石蠟包埋。切片厚5 μm，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.8 Western blot檢測(cè)心肌組織蛋白表達(dá)

取缺血區(qū)周?chē)男募〗M織稱(chēng)重后放入液氮中保存，采用Western blot法檢測(cè)心肌組織中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、p62、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)。取出凍存心肌組織加入適量的液氮充分研磨，用RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白濃度，每孔上樣30 μg。經(jīng) SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育1 h，采用ECL法顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 DMC對(duì)MIRI大鼠血清中CK-MB、LDH、MDA和SOD的影響

與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠血清中CK-MB、LDH和MDA水平顯著升高(P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.01)；與模型組相比較，DMC預(yù)處理組大鼠血清中CK-MB、LDH和MDA水平隨著給藥濃度的增加而逐漸降低(P<0.01)，SOD活性隨著給藥濃度的增加而逐漸升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表1。

2.2 DMC對(duì)MIRI大鼠血清中炎癥因子水平和心肌梗死面積的影響

與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高，大鼠心肌梗死面積顯著增加(P<0.01)；與模型組相比較，DMC預(yù)處理組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平隨著給藥濃度的增加而逐漸降低，大鼠心肌梗死面積逐漸減少(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表2。

表1 DMC對(duì)MIRI大鼠血清中CK-MB、LDH、MDA和SOD水平的影響

表2 DMC對(duì)MIRI大鼠血清中炎癥因子水平和心肌梗死面積比率的影響

2.3 DMC對(duì)MIRI大鼠心肌組織病理變化的影響

光鏡下可見(jiàn)，假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列規(guī)整，胞質(zhì)和胞核染色均勻，細(xì)胞間無(wú)充血和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。I/R組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂，部分心肌細(xì)胞溶解、空泡變性，細(xì)胞間大量瘀血和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。DMC預(yù)處理組大鼠心肌組織中上述病理改變隨著給藥濃度的增加在逐漸減輕。如圖1。

圖1 DMC對(duì)MIRI大鼠心肌組織病理變化的影響(HE染色×200)

2.4 DMC對(duì)MIRI大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2和表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.01)，p62蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比較，DMC預(yù)處理組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，與DMC濃度變化呈負(fù)相關(guān)，p62蛋白表達(dá)水平增高(P<0.01)，與DMC濃度變化呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 DMC對(duì)MIRI大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：1.假手術(shù)組；2.1/R模型組；3.DMC低劑量組；4.DMC中劑量組;5.DMC高劑量組

2.5 DMC對(duì)MIRI大鼠心肌組織中PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白及其磷酸化的影響

如表4和圖3所示，與假手術(shù)組比較，模型組p-PI3K蛋白表達(dá)和p-PI3K/PI3K比值顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，DMC(10、15、30 mg/kg)組的p-PI3K蛋白表達(dá)和p-PI3K/PI3K比值均顯著升高(P<0.01)，與 DMC濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而各組PI3K蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 DMC對(duì)MIRI大鼠心肌組織中p-PI3K、PI3K蛋白表達(dá)的影響

如表5和圖3所示，與假手術(shù)組比較，模型組p-Akt蛋白表達(dá)和p-Akt/Akt比值顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，DMC(10、15、30 mg/kg)組的p-Akt蛋白表達(dá)和p-Akt/Akt比值均顯著升高(P<0.01)，與DMC濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而各組Akt蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 DMC對(duì)MIRI大鼠心肌組織中p-AKT、AKT蛋白表達(dá)的影響

如表6和圖3所示，與假手術(shù)組比較，模型組p-mTOR蛋白表達(dá)和p-mTOR/mTOR比值顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，DMC(10、15、30 mg/kg)組的p-mTOR蛋白表達(dá)和p-mTOR/mTOR比值均顯著升高(P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而各組mTOR蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 DMC對(duì)MIRI大鼠心肌組織中p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)的影響

注：1.假手術(shù)組；2.1/R模型組；3.DMC低劑量組；4.DMC中劑量組;5.DMC高劑量組

3 討論

自噬是細(xì)胞通過(guò)自噬體與溶酶體的結(jié)合，來(lái)降解自身受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的過(guò)程，被稱(chēng)為Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡。自噬是把雙刃劍，生理狀態(tài)下心肌細(xì)胞自噬的存在能夠維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，缺血缺氧時(shí)期自噬的激活有利于細(xì)胞存活，在持續(xù)缺血缺氧或再灌注階段，能誘導(dǎo)自噬表達(dá)過(guò)度增強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞的存活產(chǎn)生不利影響[8-9]。機(jī)體對(duì)自噬過(guò)程的調(diào)節(jié)較為復(fù)雜，有多種信號(hào)分子及信號(hào)通路參與自噬的調(diào)控，其中PI3K-Akt通路是最為經(jīng)典[10]。

CK和LDH水平變化可以反映出心肌受損傷的嚴(yán)重程度，是常用的心肌損傷標(biāo)記物，通常存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在心肌細(xì)胞受到時(shí)缺血缺氧等損傷時(shí)，二者就會(huì)由心肌細(xì)胞滲漏到血液中，使血清中CK、LDH水平顯著升高[11]。為評(píng)價(jià)MIRI模型大鼠心肌的受損傷程度和DMC干預(yù)效果，本研究首先測(cè)定了血清中CK-MB、LDH水平，發(fā)現(xiàn)I/R模型大鼠血清中CK-MB、LDH水平顯著升高，DMC能明顯降低CK-MB和LDH水平，其效果呈現(xiàn)一定濃度依賴(lài)性，表明DMC預(yù)處理可以減輕缺血再灌注對(duì)大鼠心肌所造成的損傷。通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)心肌梗死面積和組織病理學(xué)變化 ，發(fā)現(xiàn) DMC能顯著減輕大鼠心肌梗死面積，改善組織病理學(xué)損傷。

在 MIRI發(fā)生發(fā)展的病理進(jìn)程中，炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和氧化應(yīng)激是重要的起始和促進(jìn)因素，參與了心肌損傷的全過(guò)程，其中活性氧(ROS)和炎癥細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控有重要作用。在心肌缺血時(shí)期，低氧和ATP能量耗竭引起的細(xì)胞器損傷激活了心肌細(xì)胞自噬，而在再灌注時(shí)期，氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的大量ROS加重了細(xì)胞器損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化，使細(xì)胞自噬被過(guò)度激活[12]。MDA是氧化應(yīng)激過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，其水平高低反映了脂質(zhì)過(guò)氧化程度，SOD 是體內(nèi)清除ROS重要的抗氧化酶[13]。MIRI引起缺血區(qū)周?chē)募〗M織炎性浸潤(rùn)，同時(shí)大量釋放TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥細(xì)胞因子，通過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步加重了心肌損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，DMC預(yù)處理能夠顯著提高M(jìn)IRI大鼠血清中SOD活性，抑制MDA的生成，顯著降低炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，且效果呈濃度依賴(lài)性變化。表明DMC能夠通過(guò)抑制MIRI大鼠心肌氧化應(yīng)激水平，阻斷炎癥級(jí)反應(yīng)進(jìn)程，從而起到心肌保護(hù)的作用。

LC3、Beclin1、p62蛋白是細(xì)胞自噬的重要組成部分，通常作為自噬水平的檢測(cè)指標(biāo)。Beclin1通過(guò)與PI3KCⅢ和Atg14結(jié)合形成三聚體，使自噬相關(guān)蛋白聚集并啟動(dòng)自噬。LC3 是典型的自噬標(biāo)志物，對(duì)自噬泡的形成起到關(guān)鍵作用，分為L(zhǎng)C3A、LC3B 和 LC3C三種同工型，其中LC3B 分為L(zhǎng)C3-Ⅰ型和LC3-Ⅱ型。LC3-Ⅰ型存在于細(xì)胞質(zhì)中，游離的LC3-Ⅰ型能夠通過(guò)泛素化修飾方式轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ型，并轉(zhuǎn)移到自噬體膜上，LC3-Ⅱ數(shù)量與自噬體數(shù)量成正比[15]，通過(guò)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值大小可評(píng)價(jià)判斷自噬活性的強(qiáng)弱。p62 能夠和待降解物結(jié)合，然后再與LC3Ⅱ形成復(fù)合物，最后在溶酶體內(nèi)被降解，p62會(huì)隨著自噬作用的增加而不斷地被消耗[16-17]。為了進(jìn)一步探討DMC對(duì)MIRI時(shí)自噬的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)采用WB法檢測(cè)心肌組織中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和p62 表達(dá)。結(jié)果顯示DMC預(yù)處理能顯著降低了MIRI大鼠心肌組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率和 Beclin1 蛋白表達(dá)，提高p62的蛋白表達(dá)，且效果呈濃度依賴(lài)性變化。提示自噬參與了MIRI病理進(jìn)程，表明DMC對(duì)心肌細(xì)胞過(guò)度自噬的激活有明顯的抑制作用。Akt屬于一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是調(diào)控mTOR最重要的直接上游分子，PI3K-Akt信號(hào)通路激活以后導(dǎo)致Akt活化產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)Akt蛋白的磷酸化水平反映了PI3K-Akt信號(hào)通路的被激活的程度[18]。mTOR是PI3K/Akt通路下游最關(guān)鍵的自噬負(fù)調(diào)控因子,其活性隨著MIRI所誘導(dǎo)的自噬情況不同而不斷發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[19]。在MIRI初期mTOR被抑制，心肌細(xì)胞自噬不斷增強(qiáng)，在后期為防止自噬過(guò)多，mTOR 被激活，抑制自噬直至終止自噬[20]。持續(xù)性心肌缺血缺氧和再灌注導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等病理產(chǎn)物，抑制了mTOR蛋白表達(dá)及其磷酸化，ULK1復(fù)合體被激活并誘導(dǎo)自噬泡膜形成 ，使mTOR對(duì)自噬的抑制作用減弱，自噬活性過(guò)度增強(qiáng)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DMC預(yù)處理可增加I/R模型大鼠受損心肌細(xì)胞中PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平，從而激活PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路。表明DMC對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞自噬作用的抑制主要是通過(guò)激活自噬上游的PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，DMC預(yù)處理可能通過(guò)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，抑制細(xì)胞自噬的過(guò)度激活，從而抑制氧化應(yīng)激水平，阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)程,減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有較好保護(hù)作用。