李 冰,孫 帆,陶姍姍,夏家鳳,葉崇軍,*

(1.農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點實驗室,江蘇鎮(zhèn)江 212018;2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,合肥 230061)

絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)被絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor,serpin)精確調(diào)控(Kanost,1999;Gubbetal.,2010)。Serpin家族幾乎存在于所有的生物中，擁有多種初級結(jié)構(gòu)形態(tài)，且具有保守的結(jié)構(gòu)域，是一種普遍存在的具有親核絲氨酸殘基催化位點的酶。該家族的大多數(shù)成員的蛋白質(zhì)由400～500個氨基酸組成，包含一個連接β折疊結(jié)構(gòu)域A和C的C末端暴露的反應(yīng)中心環(huán)(reactive center loop,RCL)。對serpin家族部分成員參與絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的精細(xì)調(diào)控已有許多研究，顯示這些家族成員參與調(diào)控的靶點和機(jī)制不盡相同，但它們的作用方式主要是通過蛋白互作和限制性蛋白水解實現(xiàn)對靶標(biāo)蛋白的調(diào)節(jié)功能(Jiangetal.,2005;Tripathi and Sowdhamini,2008)。

Serpin基因在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Reichhart,2005)、岡比亞按蚊Anophelesgambiae(Suwanchaichinda and Kanost,2009)、家蠶Bombyxmori(Zouetal.,2009)和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Xiongetal.,2015)等昆蟲中相繼被鑒定。在家蠶中，34個serpin基因目前已經(jīng)注釋鑒定了，并檢測了它們在微生物刺激下的表達(dá)模式(Zouetal.,2009)。近期研究表明家蠶serpin15能夠被球孢白僵菌Beauveriabassiana和藤黃微球菌Micrococcusluteus誘導(dǎo)，負(fù)調(diào)控酚氧化酶原(prophenol oxidase,PPO)反應(yīng)和TOLL通路(Liuetal.,2015)。Serpin5通過靶向細(xì)胞中的BmHP6和BmSP21下調(diào)TOLL和PPO通路(Lietal.,2016)。家蠶Bmserpin6蛋白可能在家蠶的酚氧化酶原激活以及抗菌肽表達(dá)過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用(李冰等,2016)，可能參與蛋白酶介導(dǎo)的家蠶先天免疫方面的調(diào)控(Lietal.,2017)。查宏賢等(2011)克隆了家蠶serpin4基因并進(jìn)行了原核表達(dá)和抗體制備。家蠶Bmserpin2在1993年通過克隆表達(dá)鑒定，證實是一類抗凝胰乳蛋白酶(Narumietal.,1993)，并且在血淋巴和絲腺中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量較高(Yonemuraetal.,2012)。但是目前對其生物學(xué)功能，特別是參與昆蟲天然免疫方面的功能尚不明確。本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)得到純化的重組Bmserpin2蛋白，并通過家蠶體內(nèi)實驗，結(jié)合RT-qPCR和酶活性測定等生物學(xué)方法，分析Bmserpin2的催化作用以及在家蠶自身免疫通路中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

實驗中家蠶品種為大造，保存于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所家蠶品種資源庫，幼蟲期在25±1℃溫度下用新鮮桑葉飼養(yǎng)。實驗中脂肪體、血淋巴、頭等組織取自家蠶5齡第3天幼蟲，收集后立即在液氮中快速冷凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

革蘭氏陽性菌滕黃微球菌購自Sigma公司，Trizol購自Invitrogen公司，胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、彈性蛋白酶(elastase)、蛋白酶K(protease K)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，分子克隆中所用的試劑、cDNA合成試劑盒、熒光定量試劑盒等購自TaKaRa公司，GST Fusion Protein Spin Purification Kit購自金斯瑞公司。

1.2 家蠶組織的總RNA 抽提及 cDNA 合成

取家蠶5齡第3天幼蟲(10頭)在冰上進(jìn)行解剖，收集脂肪體、血淋巴、頭、中腸、絲腺和表皮組織提取RNA，加入1 mL Trizol，混勻后加入200 mL氯仿，混勻后冰上靜置5 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清液500 μL，加入500 μL異丙醇，充分混勻后冰上放置10 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min；移出上清，用DEPC水配制的75%乙醇洗滌沉淀3次，通風(fēng)廚內(nèi)晾干后用適量DEPC水溶解沉淀，并用紫外分光光度計測定A260/A280來確定純度和濃度，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

使用TaKaRa公司First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行 cDNA第1鏈的合成，反應(yīng)體系:5×RT Buffer 1 μL,dNTPs 2 μL,RNase Inhibitor 1 μL,Oligo dT Primer 2 μL,Rever-Tra Ace 1 μL,總RNA 1 μg，加DEPC水至總體積為20 μL。PCR反應(yīng)程序:37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃ 保存。以cDNA為模板擴(kuò)增內(nèi)參引物BmActinA3，檢測合成cDNA質(zhì)量，余下的置于-20℃保存。

1.3 Bmserpin2基因克隆

根據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫家蠶Bmserpin2基因序列(GenBank登錄號:XM_012692302.2)，采用Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。以家蠶血淋巴組織cDNA為模板進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增克隆。PCR反應(yīng)體系(10 μL):2×All-in-One PCR Mix 5 μL,正反向引物(0.2 μmol/L)各1 μL,cDNA 1 μL,H2O 2 μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 90 s,重復(fù)35個循環(huán);最后72℃ 10 min,4℃保存。通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行膠分離回收，回收產(chǎn)物連接 pMD18-T載體，陽性克隆送生工生物工程(上海)股份上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in the experiment

下劃線序列分別為NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點。The underlined sequences are the restriction sites ofNdeⅠ andXhoⅠ,respectively.

1.4 重組蛋白Bmserpin2誘導(dǎo)表達(dá)

測序正確后，用NdeⅠ和NotⅠ對1.3節(jié)構(gòu)建的pMD18-T-serpin2進(jìn)行雙酶切，將產(chǎn)物連接到pET-28a(+)中，篩選陽性克隆并通過測序進(jìn)行鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，挑選陽性克隆在卡那霉素的LB液態(tài)培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)12 h；取上述菌液以體積1∶100加入到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至菌液OD600≈1；加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后使用12% SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)情況。

1.5 重組蛋白Bmserpin2純化及Western blot鑒定

目的蛋白大量誘導(dǎo)后收集菌液，4℃條件下5 000 r /min離心15 min，去除上清，用濃度為10 mmol/L、pH為7.4的Tris溶液清洗細(xì)胞。4℃條件下5 000 r /min離心15 min，棄上清；以每100 mL誘導(dǎo)后菌液加入4 mL濃度為10 mmol/L Tris的比例重懸，冰上靜置30 min；將重懸的沉淀置于冰上超聲破碎，然后4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清。按照 GE 公司 GST Fusion Protein Spin Purification Kit 說明書，鎳柱親和結(jié)合30 min；10 mmol/L咪唑洗雜蛋白，以100,200,300,400和500 mmol/L濃度的咪唑洗脫目的蛋白。

取純化后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測。40 mA恒流下轉(zhuǎn)膜80 min，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h。加入一抗(Anti-6×His rabbit polyclonal an-tibody)孵育1 h，加入二抗孵育1 h，其中壓片顯色用二抗為羊抗兔 IgG-HRP，膜上直接顯色二抗為羊抗兔IgG-AP，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.6 重組蛋白Bmserpin2生物學(xué)活性測定

為探討B(tài)mserpin2蛋白的生物學(xué)功能，將1.5節(jié)純化定量后的Bmserpin2蛋白分別與胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K進(jìn)行孵育，以檢測Bmserpin2對不同種類蛋白酶的抑制效果，從而確定其生物學(xué)活性。

分別取不同蛋白酶各1 μg，不做任何處理,作為對照組；實驗組分別按照Bmserpin2蛋白與蛋白酶質(zhì)量比1∶1和1∶2加入Bmserpin2蛋白，用PBS緩沖液將混合后體積定量至15 μL，冰上孵育10 min，加入濃度為5 mg/mL 的Azocasein的底物185 μL。上述混合液37℃水浴處理20 min后加入TCA 60 μL終止反應(yīng)；然后10 000 r/min離心3 min，吸取上清200 μL加入等體積濃度為1 mmol/mL的 NaOH顯色10 min，分光光度計檢測OD436值。

1.7 Bmserpin2基因在家蠶幼蟲不同組織中分布情況測定

分別抽提家蠶5齡第3天幼蟲的頭、中腸、脂肪體、血淋巴、絲腺和表皮組織RNA并合成cDNA，利用RT-qPCR檢測Bmserpin2在上述組織中的表達(dá)分布情況，以BmActinA3為內(nèi)參基因。RT-qPCR引物序列見表1，根據(jù)熒光定量試劑盒的說明書操作，使用Bio-Rad公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng):95℃變性30 s;95℃ 50 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)。每一樣品進(jìn)行3次獨立的生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)來自10頭個體。

1.8 重組蛋白 Bmserpin2對家蠶幼蟲血淋巴中酚氧化酶原活性的影響

將家蠶5齡第3天幼蟲冰上放置20 min后，注射純化的Bmserpin2蛋白1.5 g，設(shè)置不做任何處理和注射等量PBS緩沖液的家蠶5齡第3天幼蟲分別作空白和陰性對照組。注射6 h后，每組取5頭幼蟲取5 mL血淋巴，加入45 mL PBS緩沖液進(jìn)行稀釋，取10 mL稀釋的血淋巴加入濃度為10 mmol/mL的多巴胺溶液200 mL，室溫下測定OD490值，參考Amparyup等(2009)及Sumathipala和Jiang (2010)的方法測定酚氧化酶原的酶活性，每組進(jìn)行3次獨立重復(fù)實驗。進(jìn)一步進(jìn)行Western blot分析，方法同1.5節(jié)。

1.9 重組蛋白Bmserpin2對家蠶幼蟲血淋巴中抗菌肽基因表達(dá)的影響

已有文獻(xiàn)報道家蠶中serpin蛋白與TOLL通路調(diào)控相關(guān)(Levashinaetal.,1999;Fullaondoetal.,2011)，并且抗菌肽基因gloverin2(GenBank登錄號:692527)和moricin(GenBank登錄號:692365)常用于研究外源刺激下家蠶自身免疫免疫(Li Jetal.,2016;Li Betal.,2017)。為研究Bmserpin2是否也存在同樣的生物學(xué)功能，以未做任何處理的家蠶作為空白對照，以注射革蘭氏陽性菌滕黃微球菌的家蠶作為陽性對照，以注射滕黃微球菌和重組蛋白Bmserpin2混合物作為實驗組進(jìn)行研究，用RT-qPCR的方法檢測Bmserpin2對家蠶血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin表達(dá)的影響。

將家蠶5 齡第3天幼蟲冰上放置20 min后，設(shè)3組實驗：不做任何處理的空白對照組；注射滕黃微球菌20 μL(0.1 μg/μL)和重組蛋白10 μg混合物的實驗組；注射滕黃微球菌20 μL(0.1 μg/μL)和PBS的陽性對照組。注射1 h后取血淋巴，參照1.2節(jié)方法制備cDNA模板用于RT-qPCR，以BmActinA3為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系(10 μL):cDNA 1 μL,SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,超純水3 μL,混勻，離心，放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性50 s,60℃退火30 s,72℃延伸10 s，共 40個循環(huán)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

使用EXCEL整理實驗數(shù)據(jù)，熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用SPSS 20.0 進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏多重比較檢驗法和T檢驗進(jìn)行比較，分析目的基因的表達(dá)量及不同實驗組數(shù)據(jù)之間差異顯著性，其中P<0.05表示樣本間存在顯著差異，P<0.01表示樣本間存在極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白Bmserpin2的表達(dá)純化

通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對目的蛋白進(jìn)行體外表達(dá)，并通過鎳柱進(jìn)行親和純化得到目的蛋白Bmserpin2。通過不同濃度的咪唑洗脫目的蛋白發(fā)現(xiàn)，100～300 mmol/L咪唑即可將大部分目的蛋白洗脫(圖1:A)。根據(jù)Bmserpin2基因克隆測序結(jié)果,軟件(http:∥www.bioinformatics.org/sms/prot_mw.html)預(yù)測目的蛋白Bmserpin2大小為42.76 kD。根據(jù)考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot的結(jié)果分析,純化后蛋白為6×His融合蛋白，約為45 kD(圖1:B)。

圖1 原核表達(dá)與純化重組蛋白Bmserpin2的SDS-PAGE檢測(A)及Western blot分析(B)Fig.1 SDS-PAGE (A) and Western blot assay (B) of the recombinant Bmserpin2 after prokaryotic expression and purificationM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker;1:經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的 BL21 菌裂解液BL21 bacteria lysate induced by IPTG;2:洗滌液Washing solution;3-7：分別為100,200,300,400和500 mmol/L 咪唑洗脫的Bmserpin2蛋白的蛋白質(zhì)溶液Protein solution of Bmserpin2 eluted by 100,200,300,400,and 500 mmol/L imidazole,respectively;8:目的蛋白的His抗體檢測Detection of His antibody to the target protein.

2.2 重組蛋白BmSerpin2對不同蛋白酶的生物學(xué)活性

結(jié)果顯示Bmserpin2蛋白對于消化酶胰蛋白酶(圖2:A)和彈性蛋白酶(圖2:C)有極顯著的抑制效果(P<0.01)，而對胰凝乳蛋白酶(圖2:B)和蛋白酶K(圖2:D)影響效果不顯著，表明Bmserpin2蛋白對不同蛋白酶具有生物學(xué)活性并且表現(xiàn)出催化特異性。

圖2 家蠶重組蛋白Bmserpin2對胰蛋白酶(A)、胰凝乳蛋白酶(B)、彈性蛋白酶(C)和蛋白酶K(D)活性的影響Fig.2 Effects of the recombinant Bmserpin2 of Bombyx mori on the activities of trypsin (A),chymotrypsin (B), elastase (C) and proteinase K (D)1,4,7,10：分別為未加Bmserpin2的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K對照組Control groups of trypsin,chymotrypsin,elastase and proteinase K,respectively,with no Bmserpin2 added;2,5,8,11:分別為Bmserpin2與胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和蛋白酶K以1∶1質(zhì)量比加入的處理組 Treatment groups with Bmserpin2 and trypsin,chymotrypsin,elastase and proteinase K added in 1∶1 mass ratio,respectively;3,6,9,12:分別為Bmserpin2與胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和蛋白酶K以1∶2質(zhì)量比加入的處理組Treatment groups with Bmserpin2 and trypsin,chymotrypsin,elastase and proteinase K added in 1∶2 mass ratio,respectively.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上雙星號表示OD436值在處理組與對照組間差異極顯著(P<0.01,T檢驗)。Data in the figure are mean±SD,and double asterisk above bars indicates extremely significant difference in OD436value between the treatment group and the control group (P<0.01,T-test).

2.3 Bmserpin2基因在家蠶幼蟲不同組織中的表達(dá)

結(jié)果如圖3所示，Bmserpin2在家蠶血淋巴中表達(dá)量最高(P<0.05)，其次是在脂肪體中，均達(dá)到頭部中表達(dá)量的20倍左右，而中腸和絲腺組織中表達(dá)量也達(dá)到頭部中表達(dá)量的5倍左右，表皮中的表達(dá)量最低。

圖3 RT-qPCR檢測Bmserpin2在家蠶5齡幼蟲不同組織中的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of Bmserpin2 in different tissues of the 5th instar larvae of Bombyx mori detected by RT-qPCR圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示不同組織間基因相對表達(dá)量差異顯著(P<0.05,Duncan氏多重比較檢驗法)。Data in the figure are mean±SE.Different lowercase letters above bars indicate significant differences in the relative expression level of gene among different tissues (P<0.05,Duncan’s multiple range test).

2.4 重組蛋白Bmserpin2對家蠶幼蟲血淋巴中酚氧化酶原活性的影響

圖4(A)中的結(jié)果表明，家蠶5齡幼蟲血淋巴中PPO活性在注射重組Bmserpin2蛋白后，較未做任何處理的空白對照組和注射PBS的陰性對照組的顯著性降低(P<0.05)，為空白對照組的1/4左右，而空白對照組和陰性對照組間差異不顯著(P>0.05)。觀察不同處理組血淋巴顏色發(fā)現(xiàn)，實驗組血淋巴黑化程度明顯較對照組低 (圖4:C)。進(jìn)一步通過Western blot分析，結(jié)果如圖4(B)所示，推測Bmserpin2蛋白在家蠶血清中并未與血清中的絲氨酸蛋白酶形成穩(wěn)定復(fù)合物。

圖4 重組蛋白Bmserpin2對家蠶5齡幼蟲血淋巴中酚氧化酶原活性的影響Fig.4 Effect of the recombinant Bmserpin2 on prophenol oxidase activity in the haemolymph of the 5th instar larvae of Bombyx moriA:酶活性檢測Determination of enzymatic activity;B:血淋巴中蛋白的Western blot分析Western blot assay for protein in the hemolymph;C:血淋巴黑化觀察Observation of hemolymph melanization.1:不做任何處理的空白對照組Blank control group without any treatment;2:注射等量PBS緩沖液的陰性對照組Negative control group injected with an equal quantity of PBS buffer;3:注射1.5 g純化的Bmserpin2 蛋白的處理組Treatment group injected with 1.5 g of purified Bmserpin2 protein;M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05,Duncan氏多重比較檢驗法)。Data in the figure are mean±SE.Different lowercase letters above bars indicate significant differences among different treatment groups (P<0.05,Duncan’s multiple range test).

2.5 重組蛋白Bmserpin2對家蠶幼蟲血淋巴中抗菌肽基因表達(dá)的影響

結(jié)果如圖5所示，注射滕黃微球菌和PBS的陽性對照組較空白對照組抗菌肽基因gloverin2和moricin表達(dá)上調(diào)，而注射滕黃微球菌和Bmserpin2混合物的實驗組中g(shù)loverin2(圖5:A)和moricin(圖5:B)的mRNA水平顯著性下調(diào)(P<0.05)。這一結(jié)果表明，Bmserpin2可能抑制了微球菌對抗菌肽的上調(diào)作用。

圖5 RT-qPCR 檢測Bmserpin2蛋白對家蠶5齡幼蟲血淋巴中抗菌肽基因gloverin2(A)和moricin(B)表達(dá)的影響Fig.5 Effect of the recombinant Bmserpin2 on the expression of antimicrobial peptide genes gloverin2 (A) and moricin (B) in the hemocytes of the 5th larvae of Bombyx mori detected by RT-qPCR1:不做任何處理的空白對照組Blank control group without any treatment;2:注射藤黃微球菌和PBS的陽性對照組Positive control group injected with Micrococcus luteus and PBS;3:注射藤黃微球菌和Bmserpin2蛋白的實驗組Experimental group injected with M.luteus and Bmserpin2 protein.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05,Duncan氏多重比較檢驗法)。Data in the figure are mean±SE.Different lowercase letters above bars indicate significant differences among different treatment groups (P<0.05,Duncan’s multiple range test).

3 討論

昆蟲已經(jīng)進(jìn)化出有效的先天免疫系統(tǒng)來抵御病原體和寄生蟲的入侵(Lemaitre and Hoffmann,2007)?？咕牡漠a(chǎn)生和黑化反應(yīng)是體液免疫的兩個關(guān)鍵反應(yīng)，在黑腹果蠅中，當(dāng)入侵的細(xì)菌或真菌被識別為非自身成分時，AMPs的mRNA通過TOLL或免疫缺陷(immune deficiency,IMD)途徑開始轉(zhuǎn)錄進(jìn)行翻譯反應(yīng)。特別是，IMD通路是由革蘭氏陰性菌的識別激活的，而TOLL通路是由革蘭氏陽性菌和真菌的識別激活 (Imler,2014)。與NK-kB因子介導(dǎo)的途徑不同，黑化反應(yīng)是無脊椎動物另一種由酚氧化酶(phenoloxidase,PO)催化的普遍的防御機(jī)制，該酶由PPO蛋白水解轉(zhuǎn)化后的活性構(gòu)象 (Jiangetal.,1998)。

本實驗通過Bmserpin2組織表達(dá)量特異性分析顯示目的基因在血淋巴和脂肪體中表達(dá)量最高(圖3)，而血淋巴和脂肪體是家蠶先天性免疫中的兩個重要組織，暗示Bmserpin2與家蠶的先天性免疫相關(guān)。進(jìn)一步實驗通過將體外表達(dá)的重組Bmserpin2注射進(jìn)家蠶幼蟲后，檢測血淋巴中的酚氧化酶原活性以及觀察血淋巴黑化，結(jié)果顯示Bmserpin2可以有效抑制PPO活性和血淋巴黑化(圖4)。有報道顯示在果蠅中，Serpin27A(CG11331)、Serpin28D(CG7219)和Serpin77Ba(CG6680)負(fù)調(diào)控PPO級聯(lián)反應(yīng)(De Gregorioetal.,2002;Ligoxygakisetal.,2003;Tangetal.,2008)，本實驗結(jié)果與其他物種中serpin類似，推測家蠶Bmserpin2蛋白可以通過抑制PPO活性從而調(diào)控家蠶先天性免疫防御。同時有文獻(xiàn)報道serpin與其對應(yīng)的特異性的絲氨酸蛋白酶形成復(fù)合體，并且復(fù)合體是以共價鍵緊密結(jié)合(Boneetal.,1987)，但是本研究中未檢測Bmserpin2與其他蛋白的結(jié)合物，推測Bmserpin2蛋白對于酚氧化酶原的抑制作用是非特異性結(jié)合。

進(jìn)一步實驗通過家蠶外源微生物誘導(dǎo)AMPs，并注射重組Bmserpin2蛋白檢測相關(guān)AMPs基因表達(dá)量，結(jié)果顯示微球菌和Bmserpin2混合注射組中抗菌肽靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)被顯著下調(diào)(圖5)。在果蠅中，Spn43Ac (necrotic,CG1857)和Spn1 (Spn42Dd,CG9456) 負(fù)調(diào)控TOLL信號通路(Levashinaetal.,1999;Fullaondoetal.,2011)，而TOLL通路是由革蘭氏陽性菌和真菌的識別激活 (Imler,2014)，推測Bmserpin2蛋白是通過抑制抗菌肽基因的表達(dá)，從而調(diào)控家蠶自身免疫的TOLL通路。TOLL 通路中存在絲氨酸蛋白酶的參與，因此推測Bmserpin2 也可能是通過抑制其通路中某些絲氨酸蛋白酶的活性從而抑制抗菌肽表達(dá)的產(chǎn)生。

研究發(fā)現(xiàn),PPO的激活和TOLL通路和是由細(xì)胞外剪切域絲氨酸蛋白酶級聯(lián)介導(dǎo)的 (Kambrisetal.,2006;Anetal.,2009)。在煙草天蛾Manducasexta中，serpin1,serpin3,serpin4,serpin5,serpin6和serpin7也被證實調(diào)控PPO活性和TOLL通路 (Zhuetal.,2003;Tong and Kanost,2005;Zou and Jiang,2005;An and Kanost,2010;Anetal.,2011;Suwanchaichindaetal.,2013)。在鞘翅目黃粉蟲的幼蟲同樣也被證實一些serpin負(fù)調(diào)控PPO和TOLL通路(Jiangetal.,2009,2011)。

綜上，本研究表明Bmserpin2可能參與家蠶酚氧化酶原激活和TOLL途徑的胞外級聯(lián)反應(yīng)的免疫通路，并且使抗菌肽靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)。Bmserpin2蛋白對由革蘭氏陽性菌和真菌的識別激活的TOLL免疫通路以及調(diào)控抗菌肽的作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。