葉兆偉 ， 吳海港 ， 李盡哲 ， 劉錦妮 *， 姬萬民

（1.信陽農(nóng)林學院生物與制藥工程學院，河南信陽 464000；2.信陽市獸藥新制劑研究與創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，河南信陽 464000；3.瑞普（天津）生物科技股份有限公司，天津空港經(jīng)濟區(qū) 300308）

環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素是獸醫(yī)臨床中使用較為廣泛的抗生素之一，其主要用于畜禽相關(guān)細菌感染性疾病的預防與治療（孫建寧，2016；國家藥典委員會，2015）。體外聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星與鹽酸林可霉素具有協(xié)同抗菌作用（吳海港等，2015；劉安述等，2012），但由于二者普通制劑在體內(nèi)半衰期短，單次使用劑量較大，需要連續(xù)多次給藥才能在體內(nèi)保持有效血藥濃度，容易引起藥物的順從性差（高艷等，2014；范惠敏等，2012）。因此根據(jù)環(huán)丙沙星和鹽酸林可霉素聯(lián)合抗菌活性和臨床應(yīng)用需要研制出環(huán)丙-林可霉素長效注射液，為了科學、客觀地評價“環(huán)丙-林可霉素長效注射液”的安全性，依據(jù)《新獸藥注冊管理辦法》及相關(guān)法律法規(guī)的要求（中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局，1993），本試驗對環(huán)丙-林可霉素長效注射液進行急性毒性試驗、局部刺激性試驗和亞慢毒性試驗，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物及試劑 環(huán)丙沙星、林可霉素原料購于河南自然康生物科技有限公司，環(huán)丙-林可霉素長效注射液制備參考吳海港等（2015）的方法，生理鹽水與脫毛劑為本實驗室自制。

1.1.2 試驗動物 小鼠80只、健康成年白色家兔30只，均由鄭州大學實驗動物中心提供，合格證號 SCXK（豫）2017-0001。

1.1.3 主要儀器 A0820石蠟切片機 （Amershanm optical公司）；BHP生物顯微鏡 （奧林巴斯（中國）有限公司）。

1.2 試驗步驟

1.2.1 急性毒性試驗 預試驗：選用1月齡小鼠20只，雌、雄各半，隨機分成5組，每組4只，常規(guī)飼養(yǎng)。于試驗開始第1天分別按照10、7.5、5、2.5、1 mg/kg肌肉注射給藥，記錄小鼠的急性毒性反應(yīng)及死亡情況，包括中毒癥狀出現(xiàn)的時間、死亡時間、精神、飲食、體重變化及肝臟、腎臟器官的變化。在用藥后第6天將所有試驗小鼠頸椎脫位處死，剖檢觀察其對小鼠肝臟、脾臟、腎臟及肺臟等臟器的病理變化。

正式試驗：在室溫條件下，取禁食12 h的小鼠共50只，雌雄各半，隨機將小鼠分為5組，每組10只。各組動物均以肌肉注射給藥。根據(jù)預試驗的結(jié)果確定的最高劑量組為7.5 mg/kg，其余組間劑量為1：0.8，觀察7 d，常規(guī)飼養(yǎng)，記錄各組動物用藥后所表現(xiàn)的臨床癥狀、體征、死亡數(shù)和時間，采用改良寇氏法確定環(huán)丙-林可霉素長效注射液的半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.2 溶血試驗 按照環(huán)丙-林可霉素長效注射液臨床使用濃度（0.2 mg/kg），用生理鹽水按 1：5稀釋，將稀釋后藥液按照表1進行試驗，將各管置于37℃水浴中保溫，開始每15 min觀察試驗現(xiàn)象1次，試驗1 h以后采用每1 h觀察試驗現(xiàn)象1次，連續(xù)觀察4 h，參考中國食品藥品監(jiān)督管理局（2005）對試驗結(jié)果進行判斷。

表1 溶血試驗加樣培育mL

1.2.3 肌肉刺激性試驗 參考國家食品藥品監(jiān)督管理局（2005）方法，取健康家兔8只，雌雄各半，將家兔固定于固定箱內(nèi)，分別于一側(cè)股四頭肌內(nèi)注射環(huán)丙-林可霉素長效注射液1 mL。并以生理鹽水為對照藥物，于另一側(cè)相同部位同法注射給藥，觀察用藥部位肌肉的變化情況（如充血等）。給藥48 h后將試驗動物處死，縱向切開股四頭肌，觀察用藥部位肌肉的刺激反應(yīng)。

1.2.4 皮膚刺激試驗 參考袁伯俊等 （1997）方法，取健康家兔8只，雌雄各半，體重（2.5士0.5）kg。分籠單獨飼養(yǎng)，于給藥前24 h沿脊椎兩側(cè)相對應(yīng)部位脫毛，左側(cè)按照0.5 mL/次涂抹環(huán)丙-林可霉素長效注射，右側(cè)相對應(yīng)部位按照相同劑量涂空白基質(zhì)為對照，采用無刺激紗布固定。涂抹24 h后溫水沖洗擦拭，分別于不同時間內(nèi)觀察涂抹部位皮膚變化情況。

1.2.5 亞慢性毒性試驗 參考徐叔云等 （2002）方法，選用健康、體重（2.5士0.5）kg的家兔24只，雌雄各半，隨機分成4組，分籠常規(guī)飼養(yǎng)。根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，環(huán)丙-林可霉素長效注射液設(shè)高劑量組（1 mg/kg）、中劑量組（0.5 mg/kg）、治療劑量組（0.2 mg/kg）和對照組（生理鹽水）。肌肉注射給藥，每天注射1次，連續(xù)注射14 d。每天觀察家兔健康狀況，包括活動、采食、飲水、發(fā)病和死亡等；于第15天稱重，并對肝臟、腎臟進行組織病理學檢查。

2 試驗結(jié)果

2.1 急性毒性試驗 高劑量組（7.5 mg/kg）表現(xiàn)為給藥后小鼠出現(xiàn)精神興奮，呼吸加快，1 min后開始搖晃，伴有共濟失調(diào)，肌肉抽搐呈劃水樣，2 min后死亡。剖檢可見肝臟顏色呈深褐色，其他器官未有明顯的眼觀變化。低劑量組（3.0 mg/kg）小鼠6 d后處死，剖檢其肝臟、腎臟未有異常。各組小鼠死亡情況見表2，應(yīng)用改良寇氏法計算LD50=4.81 mg/kg，LD50的95%可信限為4.50～5.53 mg/kg。

表2 環(huán)丙-林可霉素長效注射液對小鼠急性毒性試驗結(jié)果

2.2 溶血試驗 在觀察時間內(nèi)，3～6號管未見溶血和紅細胞凝聚現(xiàn)象，第7管溶液呈紅色透明，有溶血現(xiàn)象。結(jié)果表明環(huán)丙-林可霉素長效注射液0.1～0.3 mL在4 h內(nèi)對紅細胞不產(chǎn)生溶血和凝聚作用。

2.3 肌肉刺激性試驗 給藥后各家兔健康如常，其對肌肉刺激性試驗結(jié)果見表3。從結(jié)果中可以看出環(huán)丙-林可霉素長效注射液具有輕度的肌肉刺激反應(yīng)，其范圍在0.5 cm×1.0 cm以下，肌肉刺激性反應(yīng)級的最高與最低之差等于0，家兔肌肉刺激性反應(yīng)之和小于10，表明環(huán)丙-林可霉素注射液的局部刺激試驗符合規(guī)定。

表3 肌肉刺激性反應(yīng)分級結(jié)果

2.4 皮膚刺激試驗 由表4可知，環(huán)丙-林可霉素長效注射液在涂抹后未對家兔皮膚產(chǎn)生刺激作用，表明環(huán)丙-林可霉素注射液的皮膚刺激性試驗符合規(guī)定。

表4 皮膚刺激性的評價

2.5 亞慢性毒性試驗

2.5.1 體重變化 正常治療劑量組與中劑量組家兔的體重基本變化不大，與對照組比較，差異不顯著。高劑量組體重增長低于對照組和臨床劑量組，并表現(xiàn)出精神不振、呆立或臥地不起、食欲減少等癥狀，表明高濃度藥物對家兔體重有一定的影響。

2.5.2 肝臟、腎臟組織形態(tài)學 肉眼觀察家兔的腎臟未見明顯病理學變化，肝臟稍有腫大，周圍顏色較深。通過組織切片觀察，治療劑量組腎小球形態(tài)完整，無出血；中劑量組腎小球內(nèi)有散在的出血，胞漿出現(xiàn)液化，腎小管形態(tài)正常；高劑量組腎小球內(nèi)有大量出血，，腎間質(zhì)出現(xiàn)壞死，散在血細胞、管上皮正常形態(tài)消失。常規(guī)劑量組肝索有序，肝血竇未見出血、壞死；中劑量組家兔肝臟主要表現(xiàn)為肝血竇、中央靜脈有出血，肝細胞間隙增大；高劑量肝細胞排列紊亂，肝細胞腫脹融合，肝血竇間有大量出血和炎性細胞。

3 討論

急性毒性試驗是藥物及制劑安全性評價的重要內(nèi)容，是評價受試化學物急性毒性大小的主要參數(shù)，可以根據(jù)半數(shù)致死量（LD50）的結(jié)果判斷該藥物的毒性大小及其作用靶器官。為亞急性、慢性毒性試驗設(shè)計提供資料（樓宜嘉，2011）。通常LD50值越小，化合物的毒性就越大，對靶動物和人產(chǎn)生危害的可能性也就越大 （沈建忠，2011）。研究表明，環(huán)丙沙星LD50小鼠口服為＞5000 mg/kg，大鼠為＞2000 mg/kg；小鼠及大鼠皮下注射均＞1000 mg/kg（劉明亮，2012）。 賈海艷等（2010）報道，慶大霉素和林可霉素注射液對小鼠肌肉注射的LD50為4.989 mL/kg。本研究結(jié)果顯示，環(huán)丙-林可霉素長效注射液小鼠靜脈注射LD50為 4.81 mg/kg，LD50的95%可信限為4.50～5.53 mg/kg，表明藥物的急性毒性與藥物制劑、藥物輔料以及聯(lián)合使用藥有關(guān)，尤其是聯(lián)合用藥，其提高治療作用同時也增加了藥物的毒副作用。

體外紅細胞溶血性、局部刺激性及過敏性等是藥物安全性評價的重要指標（馮小花，2007）。漆俊等（2012）以乳酸環(huán)丙沙星和乳酸甲氧芐定研制出了復方環(huán)丙沙星乳劑。該制劑對家兔肌肉注射給藥不產(chǎn)生熱源反應(yīng)，無體外溶血性或凝集反應(yīng)，不產(chǎn)生明顯的肌肉刺激性反應(yīng)，也不產(chǎn)生明顯全身過敏性反應(yīng)；萬軍梅等（2013）對復方環(huán)丙沙星燒傷凝膠毒理學進行研究表明，該制劑無明顯急性毒性和致敏作用，未見其對家兔完整皮膚和破損皮膚有明顯刺激作用。本試驗結(jié)果表明，環(huán)丙-林可霉素長效注射液無明顯刺激性，對試驗動物無致敏性，無體外溶血性，提示慶大霉素和林可霉素注射液肌內(nèi)注射給藥符合安全性要求。

臟器是機體發(fā)揮生理功能的場所，其形態(tài)結(jié)構(gòu)改變將直接影響機體的正常功能，因此病理學檢查是評價藥物毒性及安全性的直接指標 （邢守葉等，2015）。林曉輝（2015）報道，高劑量使用環(huán)丙沙星后大鼠血漿中，異染粒有增加的趨勢，在其尿液中出現(xiàn)了黃色針狀的結(jié)晶。賈海艷（2010）研究表明，高劑量使用復方林可霉素注射液對腎臟存在一定的毒性，對肝臟功能的影響較小。而本試驗結(jié)果表明，環(huán)丙-林可霉素長效注射液治療劑量和中劑量組肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，而高劑量組腎小球內(nèi)有大量出血，腎間質(zhì)出現(xiàn)壞死，肝細胞排列紊亂，肝細胞腫脹融合，肝血竇間有大量出血。從細胞形態(tài)觀察可以說明環(huán)丙-林可霉素長效注射液有一定的毒性作用，但作用機制有待進一步研究。